4.2.4导入SOD等抗氧化系统的基因

　　植物抗氧化防御系统能起到调节膜透性，增强膜结构和功能稳定性的作用。其中以SOD最为重要，是植物体内第一个清除活性氧的关键抗氧化酶。目前，有不少研究者应用遗传工程技术转抗氧化酶基因或提高抗 氧化剂含量，以期直接研究抗氧化酶、抗氧化剂与植物抗寒性表达调控的关系。将SOD的cDNA导入烟草 (Nicotiana tabacum)、番茄（Lycopersivcon esculentum)和首宿等植物中，大量表达后均增强了植株的抗氧化能 力。利用质体转化技术，将拟南芥的Fe-SOD和Nicotina plumbaginfolia的Mn-SOD基因导入玉米，获得抗寒 转基因玉米。也有研究将拟南芥脯氨酸脱氢酶反义RNA的cDNA导入拟南芥以抑制脯氨酸降低、实现其高 水平表达，显著提高转基因植株对低温和高盐的耐受性。这些方面手研究虽已取得令人可喜的效果，但距定 向操纵的目标还有相当多问题。如：需要加强对低温胁迫下植物某个生理过程中活性氧特征和不同抗氧化酶 过量表达在清除活性氧中的协同效应的研究,各种抗氧化酶反应后所生成的产物以及细胞对活性氧所形成氧 化逆境的应激机制的研究，从而更好地选择基因工程中的某些关键组分&]。

　　4.2.5导入与植物激素调节有关的基因

　　植物在抗寒锻炼中发生改变的激素主要有脱落酸（ABA)、赤霉素（GA)和植物细胞分裂素（CTKs),其中 以ABA表现最为显著。因此，导入与植物激素调节有关的基因也为植物分子育种者所关注。目前，CK合成 中第一个限速酶一异戊烯基转移酶基因（如）已被转入烟草、拟南芥、油菜、菊花、水稻等多种植物体内。外源 扣基因表达变化及额外细胞分裂素的合成对延长植物在低温环境中的持绿期及改善植株其他性状起重要作 用。Hu等的研究发现，转扣基因高羊茅抗寒性明显提高，低温条件下植株活力更强，持绿期更长te]。段永 波研究了转ipt基因水稻与对照未转基因水稻幼苗对低温胁迫的响应，结果表明，低温胁迫后，转基因植株脯 氨酸含量比对照大大提高，而叶绿素含量、POD与SOD的活性及MDA含量能保持稳定，抗寒性明显提高[40。 5农林技术提高植物抗寒性农林技术对提高植物抗寒性有重大实用价值。迄今，针对植物抗寒性弱或导致寒冻灾害发生的原因，相 关国家和地区基本上都进行了不同程度和范围的试验研究，初步探索出了有_定成效的抗寒技术路线或方法 体系，如培育抗寒品种、推广抗砧嫁接繁育、进行抗寒锻炼、配制“热性”土、适期播种和收获、优化作物种植制 度，混交栽植、丛植、群植，改善植物营养状况、合理灌溉与排水、接种丛枝菌根真菌、重视整形修剪的作用、切 实防治病虫害、健全防护林网，树盘培土、壅土护根（茎）、树干涂白、熏烟防冻、实行生物或薄膜覆盖，使用 ABA、多效唑（CCC)等植物生长调节物质进行种子包衣或直接喷施，以及加强寒冻天气预报、增强防冻减灾意 识、应用抗寒防冻技术等,其中的不少技术蕴涵着深刻的抗寒机理。

　　5.1抗寒育种

　　植物优异的抗寒性，首先来自于优异的种质与遗传。近两个世纪以来，国内外科研人员通过杂交、芽变、 诱变和实生育种等常规育种途径，已培育出许多具有优良抗寒性的果树、蔬菜、农作物和园林花卉品种，在实 际生产中发挥了重大作用。如，中国对抗寒、高产、胶木兼用橡胶树(Hevea brasiliensis)品种（系）的选育种[41 , 美国等国在葡萄（Vitis vinfera)抗寒性与高产性、优质性结合方面的辉煌育种成就4243 ,世界各国对柑橘 (Citrus reticulata)、苹果（Malus domestica) [46-7]、梨（Pyrus spp) [48、杏（P. armeniaca) [49]等植物抗寒种质资源的发掘与抗寒新品种选育（其中85%以上是实生及杂交选育而成）。科研和生产已经并将继续证明，培 育抗寒优良品种，是减轻植物冻害的有效手段和根本途径，对提高植物抗寒性非常重要,也非常有潜力。未 来，在已有成绩基础上，随着对抗寒植物资源的进一步挖掘和利用、对植物抗寒性遗传规律认识的加深以及生 物技术等新的育种手段的应用，必将涌现出更多更好的抗寒植物新品种。特别是生物技术的发展和应用，目 前已渗透到植物遗传育种的各个领域,SSR标记在植物品种鉴别、系谱分析和遗传图谱构建方面已得到广泛 应用，基于DNA分子标记遗传图的构建加速了杂种的早期选择，遗传图和物理图的结合可以克隆控制重要性 状的功能基因，遗传转化技术的应用可以更快地改良现有的植物品种M。但总体上，我国目前植物抗寒育种 等抗性育种开展的仍然比较少，且力量薄弱，人员分散、不稳定，无长远规划，对选育出的新品种也缺乏系统研 究,现代育种技术与常规育种尚不能有机结合47]。

　　5. 2 抗砧嫁接

　　嫁接是一项古老而有无穷生命力的世界性植物技术。中国是全世界公认的最早发明嫁接技术的国家。

　　利用嫁接的最初目的是进行植物的营养繁殖，充分发挥栽培品种的优良特性，现代嫁接技术主要是用来改良 植物性状。目前，嫁接在植物良种繁育中的应用有:挽救濒危植物，保持和发展优良种性，固定杂种优势，实现 丰产优质,调控植株大小，增强抗逆性和适应性,更换优良品种，控制性别，繁育无病毒良种，开展杂交制种利 用，调节成熟期，增强观赏性（如改换植物性别、人造连理树、_木多花、植物造型与组装等）；嫁接在植物新品 种选育中的应用有:保存特殊的育种中间材料，培育属间嫁接杂种（嵌合体），克服远缘杂交不亲和性,利用嫁 接产生的可遗传变异育种，以及用于无性变异的遗传稳定性测定。利用嫁接产生的可遗传变异，目前是国内 外植物生物学研究的热点之_61-52。因此,植物嫁接技术在农林业的诸多方面都有不可替代的价值。钱学 森认为：剪枝整形和嫁接技术在农业、林业中大有前途，开发一门技术性科学一 “植物嫁接改造学”，它的作 用决不亚于基因工程学。

　　植物的所有部分几乎均可进行嫁接。因此，确切讲，嫁接就是植物器官、组织或细胞间的结合。但嫁接 不是无性杂交,不是接穗和砧木机械的愈合，而是一个与愈伤反应不同的更为复杂的生理过程，是接穗和砧 木两者相互影响，相互作用，组成一个有机的整体。一种嫁接组合，是不同于另一种嫁接组合的，也不同于砧 木本身或接穗本身。大量试验表明，选用抗性强的适宜砧木进行嫁接，可显著提高栽培品种对寒冻等生物非 生物逆境的抗性，但迄今对嫁接植物的代谢过程、砧木与接穗联合效应的作用机理以及嫁接植株的遗传状况 等尚有许多不明确之处,作用机理研究还不是很深入。概括起来，抗砧嫁接提高植物抗寒冷性的作用机理是： 1)低温胁迫下，嫁接苗较自根苗根系吸收养分与水分能力显著增强;2)嫁接苗较自根苗在矿质吸收、激素代 谢、膜保护酶系活性、糖和蛋白质含量等方面均发生了利于抗寒性提高的明显变化;3)嫁接苗较自根苗根系 在低温条件下伸展性好，根系和叶片的致死温度显著低于自根苗，叶片保水力较强，能量代谢水平较高;4)嫁 接后抗寒性的提高与植物体内活性氧清除系统中抗氧化剂含量和抗氧化酶活性提高有关，嫁接苗的活性氧清 除能力均高于自根苗，抗寒性越强的活性氧清除能力越高;5)低温胁迫下，植物嫁接苗较自根苗的细胞之间 存在活跃的长距离信号转导和遗传物质交换。

　　5.3抗寒锻炼

　　植物对低温胁迫的抗性有一个适应过程。在植物遭遇寒冻害之前，逐步降低温度,使植物预先经受适当 的寒冻锻炼，可有效提高对更低温度的抗性，否则，极易在突然遇到低温时受害。春季在温室、温床育苗，进行 露天移栽前，必须先降低室温或床温，如番茄苗移出温室前,须先经1 一2 d、10°C处理,移栽后即可抗5°C左右 的低温；黄瓜苗经1〇°C低温锻炼后即可抗3 - 5°C的低温;植物愈伤组织及组织培养苗，经17°C /12°C昼夜低温 锻炼可明显提高2-4C低温胁迫下的抗寒性,植株存活率和细胞活力显著提高；经过抗寒锻炼的冷地型草坪 草-草地早熟禾、沟叶结缕草,了5。分别降低-8.8°C、-2.7°C M。

　　低温锻炼提高植物抗寒性，实质是化学模拟植物胁迫，有着深刻的生理生化学与分子生物学原因。概括 起来主要是:1)通过低温锻炼后，植物细胞内的生理生化代谢发生变化，含水量发生变化，自由水减少，束缚 水相对增多;2)膜脂组成和结构改变，不饱和脂肪酸增多,膜流动性增大，膜相变的温度降低,膜透性相对稳 定或增大幅度小;3)细胞质中的渗透调节物质，特别是糖类（包括葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖）含量提高， 一些多羟基醇，如山梨醇、甘露醇、乙二醇，以及多胺类化合物、脯氨酸、Ca2+等抗寒物质分子的含量也提高，升 高的Ca2+来源于细胞壁;4)细胞内NADPH/NADP比值和ATP含量增高，激素比例发生改变，脱落酸（ABA, 有‘‘可传导的锻炼促进剂”、抗冷基因表达的启动因子之称）增多;5)基因表达改变,特别是改变了 cor基因的 转录和蛋白合成模式，合成了一些新蛋白，或某些蛋白的合成增加，而另一些蛋白减少或消失，可溶性蛋白的 质和量改变，膜指代谢过程中的一些酶类如磷脂酶D的活性变化。

　　抗寒锻炼是如何启动膜脂代谢的变化，膜脂分子如何调节其它代谢的变化，与抗寒性有关的物质分子又 是如何有序、协调调节抗寒力的表达的，在低温逆境生理生态研究中广受关注。现已知，Ca2+~CaM信使系统 是调节植物抗寒性形成的有关生理生化过程的重要信号系统，启动的一个中心环节就是胞质中Ca2+浓度的改 变，参与胞质中Ca2+水平的调节有质膜上Ca2+通道活性、Ca2+-ATPase以及Ca2+/H+反向传递体。植物细胞内液泡是很重要的贮钙体，普遍存在于液泡膜上的Ca2+/H+反向传递体及Ca2+通道也与胞质中Ca2+水平变化密 切相关。Ca2+完成信息传递功能是通过Ca2+调节靶酶,如蛋白酶激酶，以及Ca2+结合蛋白特别是CaM,进而 调节靶酶，完成对生理生化的调节。磷脂酶D能感知低温的信息，进而调节膜脂的代谢，改变了膜脂成分，而 磷脂酶D的活性受Ca浓度的变化所影响。又由于Ca2+的共轭性，使得Ca2+信使系统与磷脂酰肌醇信使系统 相关联，磷脂酰肌醇系统中DG和IP3两种信使物质对调节生理变化起着重要作用66。

　　5.4水肥耦合

　　合理施肥，包括增施有机肥，无机肥和有机肥相结合,特别是调节氮（N)、磷（P)、钾（K)肥比例，实行平 衡施肥、配方施肥，对植物的长势、经济产量和品质及抗逆性可产生重大影响，是提高植物抗寒性的重要措施， 相关报告非常多。如：按N :P2〇5:K2O为8:3:3配合施肥对腰果(Anacardium occidentale)树促花增产效应及冬 季抗寒性的显著提升作用B7]，以N:P2〇5:K2〇为2:1:1配方施肥对温州蜜柑产量、品质和抗寒性的提升效应 最大。增施钙（Ca)肥22-23’59]、硅（沿）肥650以及铁（Fe) 61和稀土微肥652 ,对提高植物抗寒性也有比较显 著的效应。其实，每一种矿质元素在提高植物抗寒性中都有特殊作用，如前已述及的Ca元素。酸性土壤供 Ca2+水平较低是植物易受冻害的土壤学原因，而低温胁迫下加Si处理后高抗植物品种体内较高的Si含量是 其比低抗品种具有更强抗寒性的原因之_M。

　　水是植物细胞的重要组成成分，是代谢过程的反应物质，是各种生理生化反应和物质运输的介质，植物正 常的生命活动都必须在细胞含有一定水分的状况下才能进行。水还具有特别重要的生态学意义，如调节植物 体温，改善田间小气候，使植物保持固有姿态，可“以水促肥”实现“水肥耦合”效应等。如果植物在湿度不良 的土壤或基质中长期生长,根系就不能健康生长，必然导致植株发黄，叶缘枯焦，叶片早落，枝条死亡,果实或 种子减产甚至绝收。因此，水分管理对提高植物抗寒性具有非常大的作用。我国果树生产中对于水分管理强 调“前促后控，促控结合’、“春水早，夏水巧，秋水控，冬水饱”所体现的就是合理灌溉的思想,也是防止植物 特别是木本植物冬春时节“冻旱’、1抽梢’、1抽干”的重要措施653。

　　研究和实践表明，合理灌溉施肥、“水肥耦合”是植物健康生长的基本措施之干旱或涝渍胁迫对植物 生长发育和抗寒性具有同等危害，不结合施肥的灌水与不结合灌水的施肥都不利于植物水肥利用效率和抗寒 性的提高，然而，在植物特别是栽培作物频繁发生寒冻灾害的地方这一点往往被忽视。目前，现代灌溉技术装 备正在得到普及，各种先进的微灌技术,如滴灌、微喷灌、涌泉灌，实现了灌溉土地向灌溉植物的跨跃，实现了 灌溉施肥的有机结合,不仅具有节水、节肥、省工的功效，而且，对提高植物抗寒性也发挥着实实在在的重要调 节作用。

　　5.5化学诱导

　　激素被认为是抗寒基因表达的启动因子。植物生长调节剂能有效地影响和控制植物的生长发育及对低 温胁迫的适应性。植物抗寒性的化学诱导，是基于人们对植物抗寒机理的深入研究，尤其是对植物抗寒化学 信号物质的种类、性质和作用的透彻了解。尽管化学诱导效应不能瞬间见效，但在某些条件下应用技术成熟、 效应显著。目前，实践中使用的抗寒化学诱导剂，最多的是植物系统抗寒性形成过程中起低温胁迫信号转导 物质的一类分子及其衍生物，如寡糖素,水杨酸（SA)及其衍生物,脱落酸(ABA)及其衍生物，乙烯（ETH)、细 胞分裂素（CTKs),茉莉酸（JA)和茉莉酸甲脂（Me-JA),以及矮壮素（CCC)、多效唑（PP333)、油菜素内酯 (BRs)。

　　普遍认为，茉莉酸在许多方面，可以起到脱落酸的一些生物学效应，所以在实践中获得了广泛应用。乙烯 可以独立于脱落酸途径之外,激活植物的抗性基因。乙烯作为一种气态激素，对植物个体间的抗逆诱导通讯 具有重要意义，实践中经常使用乙烯利发生乙烯，或用低浓度ABA刺激植物产生乙烯，以达到抗逆诱导的目 的。业已证实,ABA在植物系统抗性的形成过程中具有特别重要的地位，是极其重要的抗寒诱导剂。使用 CCC、PP333等生长延缓剂来提高植物抗寒性已普遍应用于生产实践。多数诱导剂施用后增强植物抗寒性的 作用机理主要是：促进ABA生物合成，诱导活性氧清除功能增强，利于糖类、可溶性蛋白等渗调物质的积累，调节植物生长发育。

　　6展望

　　植物抗寒性具有不稳定性，同时，其表现是多方面的，由诸多环节构成，并随时间、温度、光周期、含水量、 发育时期、营养状况、基因型等因素的不同而有改变。目前,对这些复杂因素和环节与植物抗寒性的关系有许 多并非很清楚,对植物抗寒性的几个方面或诸多环节间的联系尚缺乏全面了解。以下3方面的深人研究应该 是非常有价值的：（1)强化抗寒生理学与育种学的联系,使抗寒机理研究与抗寒技术创新紧密结合起来；（2) 植物第二信使在低温胁迫下的作用机制及其在提高植物抗寒性中的功能；（3)现代矿质营养与管理在植物抗 寒生理及生态适应性中的重要作用。

　　以往研究中已从低温信号的识别、转导、信号级联放大、响应等方面对植物低温信号传递网络进行了有_ 定深度的剖析，但对低温胁迫下相关分子应答途径、基因转录调控方面的研究还不够深入。低温会引起代谢 过程及大量产物的变化，对于调控这些过程的转录因子及关键功能基因、相关交叉信号途径的全面了解与解 析，将有助于植物抗寒新品种的培育。同时，植物抗寒性又是由多个微效基因控制的数量遗传性状，由_系列 相关的直接或间接作用的基因构成了一个复杂的调控网络，尽管通过转基因技术可在_定程度上提高植物的 抗寒性，但仅靠转移_、两个抗寒基因就想获得抗寒植物有_定难度。

　　对植物感受和转导寒冷信号的机制，植物抗寒冻的确切分子机制尚不是很清楚。ABA与Ca2+信号转导 途径如何协同作用将寒冷胁迫信号传递到细胞核的转录因子，转录因子如何调控抗寒基因的表达，诸抗寒基 因又是如何发挥抗寒活性等的分子机制研究应是植物抗寒冻基因工程的基础。植物低温诱导蛋白质的研究 虽然已取得很大进展，但迄今对低温诱导蛋白质的研究主要还是通过分析其与已知蛋白质的同源性及一些生 理现象确定的，除少数确定为植物适应胁迫过程中的必需蛋白质外，大部分低温诱导蛋白质的功能及其表达 机制仍不清楚。随着全序列测定物种的增加以及大量表达序列标签（EST)的产生，精细遗传和物理图谱的构 建，反向遗传学、蛋白质组学和比较基因组学在基因功能研究中越来越显示出重要性，人们对复杂信号的表 达、传递和代谢系统的了解必将越来越清晰。

　　在与植物抗寒冷性有关的生物化学与分子生物学研究方面,如下三点有必要重视：（1)质膜液晶态稳定 性应是植物抗寒研究的_个重点。由于低温锻炼提高植物对低温的抗性除了诱导产生冷反应基因外,也增加 了膜对低温抗性的稳定性，因而,冷反应基因产物与质膜液晶态稳定性的关系应成为研究的重要课题之_。 (2)尽管通过低温锻炼、改善矿质营养或植物激素处理的研究表明，植物对低温抗性的提高与微管在低温下 的稳定性之间存在密切联系，但有关激素调控元件或者转录激活因子调控的基因产物是否直接或间接调控微 管或微丝的动态特性仍缺乏实验证据，这_工作的深入对阐明植物对低温的抗性乃至植物抗逆的分子机制具 有重要的理论和现实意义。（3)分离、鉴定植物在低温诱导过程中产生的冷反应基因、相关的基因以及它们 之间的相互作用，对确定植物对低温胁迫的分子反应和信号传递的一些关键环节，特别是细胞骨架的调控机 理具有重要意义。

　　由上也可见，虽然提高植物抗寒性的机理研究已经取得很大进步，但对主要生理过程之间的关系的研究 分析仅限于少数植物种，如拟南芥及部分农作物，因此，有的机制的普适性可能需要更广泛、更深入的研究。 同时,在研究手段上，目前很多研究采用人工气候室模拟低温胁迫，虽然可以很好的指示单一胁迫对植物的影 响，但是用其来推断野外实验结果有很大局限性，甚至有时控制实验与野外试验的结果相互矛盾，在未来的研 究当中应多结合野外实验，并充分关注现代产业条件下植物抗寒性的研究、提高。