2.2.4低温胁迫下植物细胞的抗氧化能力

　　低温胁迫下,对低温胁迫敏感的植物细胞中活性氧的产生加速，而清除活性氧的能力下降,导致活性氧水 平升高。因此，低温胁迫下活性氧所引起的损伤是伤害产生的重要原因之_。另一方面，研究也证明，冷锻炼 可提高细胞内抗氧化酶活性和内源抗氧化剂水平，缓解由低温胁迫而引起的膜蛋白和膜脂过氧化，从而提高 植物抗寒性。同时，植物不同的抗寒性又与其细胞内具有不同水平的抗氧化酶活性和内源抗氧化剂含量相 关，抗寒植物比冷敏感植物具有更高水平的抗氧化能力。Ca2+浸种等处理能够提高植物抗寒性，均与提高了 植物抗氧化胁迫能力有关。因此，有学者认为，细胞氧化应激机制很可能是调节植物抗寒性的另_个重要 机制7。

　　3植物抗寒性的遗传机制与调控

　　多数植物经低温锻炼后，抗寒冻能力都增强。植物在低温锻炼下，通过上游调控来维持呼吸作用、光合作 用和蛋白质合成代谢，进而获得对寒冻的抗性。在人工低温锻炼过程中，一系列低温诱导基因被诱导表达，植 物系统获得性抗寒冻能力与低温诱导基因的诱导表达密切相关。研究低温诱导基因及其表达调控的方法是： (1)运用现代分子生物学技术，包括高通量cDNA微阵列或基因芯片技术、酵母单（或双）杂交方法、DNA标签 法和差别显示技术等直接分离和冷锻炼相关的基因以2)运用正、反向遗传学方法，包括图位克隆法、转座子 或T-)NA插入的定向基因失活技术、反义RNA和共抑制技术以及基因沉默技术，筛选和研究大量突变体中 的低温胁迫基因作用位点和功能；（3)运用分子探针分析酶切扩增多态序列（CAPS)、限制性片段长度多态性 (RFLP)和数量性状座位（QTL)谱确定低温诱导基因遗传图08。目前，大量与植物低温诱导表达相关的基因 已得到分离、鉴定，但一些基因的表达与植物抗寒性之间的关系还未全面揭示。基于胁迫损伤或耐性表型的 遗传筛选方法，与现代分子生物学技术相辅相成，在植物低温转录因子表达、胁迫信号传递和代谢途径的研究 中发挥着越来越重要的作用。

　　3.1丰富多样的植物低温诱导蛋白

　　低温诱导蛋白质中有直接与提高植物抗寒性、保护细胞免受冻害的功能性蛋白质。如：胚胎发育晚期丰 富蛋白（LEA蛋白）、抗冻蛋白（AFP)、DNA结合蛋白、mRNA结合蛋白、分子伴侣、离子通道蛋白、bZip蛋白以 及能保护其他酶类的蛋白质等；能改变膜脂组成的合成酶如脂肪酸不饱和酶;能降解毒性物的抗氧化胁迫酶 包括超氧化物歧化酶（SOD)、过氧化氢酶（CAT)、过氧化物酶（POD)等;也有能调控低温信号传导、抗寒冻基 因表达和抗寒冻蛋白质活性的调控性蛋白质，包括低温转录因子、蛋白激酶以及_些蛋白酶07。

　　LEA蛋白主要出现在种子胚发育的晚期，具有富含Lys的K节和富含Gly的$节。研究低温诱导蛋白 质的结果表明，许多低温诱导蛋白与LEA蛋白在氨基酸序列上有高度同源性，结构上普遍具有以下特点:含 有大量亲水性氨基酸,在沸点下保持稳定;氨基酸组成简单，仅由几种氨基酸构成,Gly、Ala含量较高；具有重 复序列结构，内部缺少折叠区，受热难于聚集；形成双亲a-累旋，其疏水区与部分变性蛋白质及膜相互作用， 阻止蛋白质和膜进一步变性,而亲水区与其它蛋白质结合，可能具有蛋白质分子伴侣的作用，在低温下稳定膜结构与功能。低温诱导基因表达调控的机理很复杂。目前，世界上已分离、鉴定出十几种低温诱导基因，研究对象主要是模式植物拟南芥（Arabidop sis thaliana)以及水稻iOryza sativa)、大麦{Hordeum vulgare)和苜蓿 (Medicago saliva) ^。

　　3.2低温转录因子DREB/CBF可同时调控多个植物低温诱导基因的表达高等模式植物拟南芥低温诱导基因cor,也称kin 、rd、lti 或 erd 基因，所编码的多肽根据氨基酸组成可分成 四类：匸0尺6.6/1(1犯、匸0尺15&、尺029入/[丁178/匸0尺78和匸0尺47爪017,其中匸0尺6.6蛋白与富含丙氨酸的 鱼类抗冻蛋白I在氨基酸组成上极为相似,RD29A和RD17蛋白类似于LEAH蛋白，COR15a蛋白可能与质 膜相互作用，可阻止六方晶n相发生，提高低温胁迫下质膜的稳定性，增强叶绿体和原生质体的抗寒冻 能力M。

　　研究基因缺失和碱基突变的结果表明，COR15a基因启动子的顺式作用元件包括上游的C-epeat元件和 下游的ABA响应元件ABRE。C-epeat元件，也称CRT或DRE或LTRE,其核苷酸序列是TGGCCGAC;ABRE 元件，具有保守的6核苷酸序列TACGTG。此外，在rd29A基因启动子的顺式作用元件中也发现ABRE以及 类似于CRT的脱水响应元件DRE,其核苷酸序列是TACCGACAT Efl。目前，已确认CRT/DRE /LTRE元件或 其核心序列CCGAC广泛存在于低温、高盐及脱水应答中一些诱导基因的启动子中，但它对ABA的快速诱导 没有响应M。

　　采用拟南芥c〇r15a或rd29A基因的CRT/DRE元件，以及酵母单杂交方法，经凝胶移位和基因芯片技术, 结合位点选择分析以及反式激活分析，已经分离和克隆了与低温胁迫耐性相关的转录因子CBF1,2,3,4 / DREB1B,1C,1A,1DM。CBFs具有AP2/ERFDNA结合域，可以识别和结合CRT/DRE元件。正常生长条件 下，野生型拟南芥植物中的CBFs、cor6. 6、cr15a、cor47和rd29A基因不表达，但低温冷锻炼15min后体内的 CBFs基因开始表达，约2 h左右前述cor基因表达。CBF1或CBF3组成性过量表达，可促进下游的cor基因 也组成性地高水平表达，与cor15a单独表达相比，它可以使整株转基因植物抗冻性提高3. 3°C M。用含基因 的启动子控制DREB1A在转基因拟南芥植物中表达，植物的抗寒性、抗旱性和耐盐性提高。遗传分析发现, ICE1作为CBF3的激活子，能识别和结合CBF3启动子的MYC/B序列。转ICE1基因植株的CBF3, RD29和 COR15a在低温下高表达M。

　　最近发现的转录因子CBF4显示了植物对低温和干旱胁迫反应进化上的相近性。CBF4受干旱胁迫诱 导,但不受低温胁迫诱导。在转基因植株中，过量表达的CBF4植株不但抗旱能力增强,而且抗冻性也提高。 CBF4的原始基因很可能具有调控植物对干旱胁迫作出响应的功能，经过基因复制、启动子趋异及选择、外显 子重组等作用，逐渐具有调控植物抗寒性的功能M。由于CBF/DREB能诱导多种与胁迫相关的基因表达而 极大地增强植物抗逆性，因此,具有广泛的应用价值，目前是研究热点之有许多研究机构利用导入该转录 因子来提高植物抗寒性、抗旱性，并且获得了一定的成功。

　　3.3 CBF/DREB与辅助因子相互作用调控下游基因表达在一些基因表达过程中，转录因子并不直接与顺式作用元件结合，经过辅助因子活化后才能调控下游基 因表达。在拟南芥中发现有类似酵母的适配器（adaptor) ADA2和具有组蛋白乙酰转移酶（HAT)活性的GCN5 蛋白。目前推测,CBFs激活低温诱导基因表达依赖GCN5和ADA2的相互作用。CBFs的酸性C端可能引导 复合物到基因启动子，使HAT修饰组蛋白，改变染色质结构,使之更容易与mRNA聚合酶结合。T-)NA插入 ADA2和GCN5中，导致拟南芥突变体植株的cor基因转录本降低，但对CBFs表达没有影响E7]。用遗传突变 方法还筛选到能影响cor基因表达但对CBF/DREB1转录因子没有影响的遗传突变位点，这可能会成为研究 低温胁迫信号传导和胁迫基因功能的有力工具。拟南芥冷敏感突变体fr6就是其中的一个。Boyce等利用基 因敲除及分子标记技术，筛选到拟南芥冷冻敏感突变体fr,对冷冻处理显示出不同的生长发育和细胞生理损 伤行为，其中在fr6突变体中检测不到cor基因表达但与cor基因启动子CRT/DRE元件结合的CBF/DREB1 基因表达正常。据此，他们认为，SFR6蛋白可能对CBF/DREB1激活下游基因表达起正调控作用18。

　　植物体内代谢物的合成与分解,总是处于微妙的动态平衡状态以感应外部环境变化和维护机体正常代 谢。Ishitani等在拟南芥中发现的HOS1蛋白可能是参与降解与CBF/ DREB1表达相关的一种正调节器，对冷 信号传递进行负调控M。拟南芥hosl突变体能在低温下提前开花，其CBF/DREB1表达水平高于野生型，且 cor基因过量表达。研究还发现,HOS1具有泛素功能，可降解ICE1,此后发现的转录因子HOS9则可以对cor 基因表达进行负调控，但不依赖于CBF途径20。通过遗传突变研究发现的另一个对低温胁迫有负调控作用 的基因是esk1。esk1突变体植株与其野生型植株相比，脯氨酸和总糖含量高，RAB18 (LEA n )高表达，抗寒性 强，但对COR基因的表达没有影响。拟南芥转录组-表达谱的研究结果也证明，植物在冷锻炼过程中存在低 温诱导基因表达的抑制途径M。