3.4 Ca2+、ABA及蛋白质磷酸化上游调控低温诱导基因表达植物在感受到寒冷信号，如气温降低、短日照等之后,将产生一系列抗寒促进因子，启动一些抗寒基因的 表达。要实现这些反应，必须能够顺利完成从刺激到准确反应的一系列信号转导过程。现已知，Ca2+、ABA及 蛋白质磷酸化上游调控低温诱导基因表达。

　　3.4.1Ca2+

　　Ca元素，不仅是细胞的结构物质，而且，作为第二信使几乎介导了植物生长发育和对低温胁迫等环境变 化的全部反应。低温或激素不仅引起细胞质内Ca2+水平升高，且引起细胞核内Ca2+浓度迅速增加。对ABA 不敏感型突变体的研究也证实Ca2+参与低温胁迫下的信号转导。细胞质内Ca2+浓度较低（矣0. 10^mol/L), 而细胞壁、内质网和液胞中Ca2+浓度比细胞质中高2个数量级以上。这些部位或细胞器称为细胞的“钙库” 细胞壁是“胞外钙库’，“胞内钙库”包括液泡、内质网和线粒体等。植物细胞中有精细的Ca2+浓度调节机制， 主要是Ca2+通道、Ca2+/H+交换体、Ca2+-ATP酶和Ca2+结合蛋白。胞内Ca2+分布严格区域化，保持胞质Ca2+稳 态是细胞正常生长的前提条件。细胞受刺激后，胞质中的Ca2+浓度短暂而明显升高。胞质中Ca2+浓度升高， 源于胞外和胞内钙库。胞外Ca2+可顺化学势梯度通过质膜上的Ca2+通道进入细胞质，胞内Ca2+通过内膜上的 Ca2+通道进入胞质。骤然低温引起抗寒植物叶片气孔关闭，该过程依赖于细胞质外体中的Ca2+供应,而与通 常引起气孔关闭的ABA无关。这可能与温度变化引起细胞质pH值改变有关22。

　　细胞膜上的钙离子通道和钙依赖型蛋白激酶（CDPKs)等信号感受器，接受低温胁迫信号后诱导细胞释 放Ca2+,或诱导细胞产生肌醇多聚磷酸盐、ADP核糖以及NADP盐等二级信号分子，从而刺激细胞释放 Ca2+,激活蛋白激酶参加蛋白质磷酸化代谢过程,诱导胁迫靶基因表达。用Ca2+螯合剂、Ca2+通道阻断剂和转 Ca2+通道蛋白基因技术的研究结果表明，Ca2+参与植物对低温胁迫的响应，并与植物的一些低温诱导基因的 表达调控相关，如拟南芥的cor6. 6/kin1、苜蓿的cas15 23。通过改变二级信号分子的生化代谢途径，影响Ca2+ 流释放水平，可调节低温胁迫基因表达，影响植物抗寒性。当细胞中的肌醇磷脂系统（IP3)被激活后，也可促 使内膜系统中Ca2+的释放，因为IP3具有打开Ca2+通道的功能。IP3是水溶性的，可从质膜扩散到胞质溶胶, 然后与内质网或液泡膜上的IP3~Ca2+通道结合而使通道打开。IP3的生理功能都通过Ca2+浓度升高引起，由 Ca2+作为第二信使介导完成。实验表明，Ca2+能明显提高低温胁迫下植物种子的生活力和萌发率，Ca2+浸种可 使水稻等植物的种子在低温吸胀过程中电解质渗漏率明显降低，说明Ca2+对冷害种子细胞膜结构有稳定 作用。

　　3.4.2ABA

　　早在20世纪80年代初，人们就注意到植物抗寒性与ABA有关。虽然低温锻炼（4°C/2°C)或用外源 ABA处理能诱导低温诱导基因表达、增强植物抗寒性，并且ABA缺失突变体aba-1或不敏感突变体abi-1的 ABA合成受阻或对ABA的作用不敏感会导致植物耐冻性下降，但aba-1突变体植株的cor基因表达正常，且 abi-1能影响ABA诱导的cor基因表达而不影响低温诱导的cor基因的表达,ABRE缺失也不影响低温胁迫因 子对CRT/DRE的诱导表达M。根据基因表达对ABA的依赖与否，可将低温下信号传导ABA诱导的基因分 为三类：（1)基因表达依赖ABA的传导（如：种子贮藏蛋白基因和逆境诱导基因）；（2)冷诱导基因表达不依赖http I / /www. ecologica. cnABA的传导途径；（3) ABA与低温共同作用控制基因的表达。有学者在分析了拟南芥突变株在低温胁迫响 应中的信号转导途径后指出，依赖和不依赖ABA的信号转导途径并不是完全不相关的，而是存在交叉转导 作用。

　　用萤火虫荧光素酶基因（rd29A~?uc)转基因植物为材料，分离到两个拟南芥突变体1〇s5和1〇s6,这两个突 变体植物不能合成ABA，d29A、C〇r15a和C〇r47等的表达也比野生型低。遗传分析表明，os5是aba3的等位 基因,os6是abal的等位基因，而且,ABA与Ca2+~CaM信号系统共同执行抗寒信号的传导M。外源ABA的 抗寒性诱导作用已在棉花（Gossypium hirsutum)、首宿、油菜(Brassica campestris L.)、黄瓜（Cucumis sativus)、水 稻等植物中得到证实。低温锻炼和ABA处理都具有增强植物抗寒性的作用。目前，已发现有多种基因的表 达可为外源ABA所诱导，其中大多数基因在种子后熟期或植物器官对逆境胁迫反应时表达。喷施外源ABA, 水稻幼苗在低温胁迫下及回温恢复中SOD活性增强，但水稻幼苗SOD活性增加并非激活该酶而是促进了该 酶的再合成。

　　3.4.3蛋白质磷酸化

　　拟南芥fy 1基因编码肌醇多聚磷酸盐1^磷酸酶,能降解信号分子肌醇1,4,5-三磷酸盐（IP3),对冷信号 传递进行负调控。fyl突变体的IP3含量比野生型高,cor基因表达增强，抗寒性提高M。实验结果表明，低 温诱导细胞内的Ca2+量增加，从而激活CDPK,增强水稻（Oryza sativa L.)抗寒性、抗旱性的。用基因沉默技 术，可抑制分解CDPK的蛋白质磷酸酶2 C基因表达、促进冷诱导基因表达，提高转基因植物的低温锻炼水平128。

　　蛋白激酶催化蛋白质磷酸化，有蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白质酪氨酸激酶和蛋白质组氨酸激酶3 类。越来越多的证据显示，蛋白激酶参与植物低温逆境信号传导。苜蓿促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)基因 mapk14可被低温和干旱快速激活，它在接收由第二信使传导的多种细胞内集成信号中起关键作用。MAPK 级联系统包括3种蛋白激酶，即MAPK、MAPK激酶（MAPKK)和MAPK激酶激酶（MAPKKK)。首先， MAPKKK接受低温逆境刺激信号，由失活型转变为激活型，从而进一步激活MAPKK,激活型MAPKK又会进 -步使MAPK激活，向下传导信息。实验证实，MAPK级联系统在参与植物低温胁迫信号传导时，其信号传 导元件mRNA水平上升以提高相应蛋白含量，将外界胁迫信号级联放大29。此外,有些报道表明，在某些植 物中，对抗寒锻炼起作用的并非一类激素的绝对含量，而是与GAs -类激素的比例。因此，有人认为ABA/ GAs更反映出植物的抗寒性。

　　3.5不饱和脂肪酸酶基因的表达

　　Roughan在研究74种植物膜上的磷脂酰甘油（PG)脂肪酸组成与抗寒性之间的关系时发现，细胞膜脂肪 酸的不饱和度对植物抗寒性有很大影响，细胞膜脂的不饱和脂肪酸含量愈高，植物的抗寒性愈强。用脂质体 原生质体融合和基因转化技术，转化甘油-3^磷酸酰基转移酶基因和转w-3脂肪酸去饱和酶基因/ad2~8的水 稻植株,可以降低或增强转基因植株抗寒性。但拟南芥的另一个突变体fab1的PG饱和脂肪酸表达水平却提 高，植株的抗寒性也增强，显示PG饱和度并不是唯一影响植株抗寒性的因素，可能还有其他因子参与低温 调控。

　　膜脂降解与植物抗寒性关系的证据主要来源于对磷脂酶PLD的研究。PLD是催化膜脂分解的主要酶之 一。低温胁迫下,PLD介导的膜磷脂的分解得到强化。有学者将编码PLD和反义PLD的基因分别转人烟 草,转反义PLD转化株抗寒性获得提高，而转PLD转化株的抗寒性下降。无疑，不饱和脂肪酸,特别是某些膜 脂中的不饱和脂肪酸分子种（PG分子种）对植物抗寒性的形成具有重要的作用，而且通过对脂肪酸的去饱和 作用或抑制膜脂的降解进行遗传操作已证明可以改变植物对低温胁迫的敏感性61。膜脂脂肪酸的去饱和作 用是调节植物抗寒性的一个重要机制。

　　4基因工程改良植物抗寒性

　　1970年，科学家首次提出了植物在适应低温胁迫的过程中基因表达发生改变的观点。此后的研究发现，抗寒锻炼/冷锻炼能诱导和增强植物的一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。目前，国内外的植物抗寒 基因工程主要是针对以上两类低温诱导基因加以展开的。

　　4.1导入抗寒调控基因

　　植物在感受和传导寒冷信号的过程中，有多种调控基因参与编码产生信号传递因子和调控蛋白，包括各 种转录因子和蛋白激酶，如DREB转录因子、细胞分裂蛋白激活激酶、14-3-3蛋白等。目前，有关导入抗寒调 控基因的研究主要围绕与抵抗寒冻所导致的渗透胁迫相关的低温诱导基因转录因子DREB展开M。研究发 现，植物在抵抗寒冻所造成的渗透胁迫过程中，有多种基因得以诱导表达，且多数在转录水平调节的低温诱 导基因和水分胁迫诱导基因的启动子区域有一个顺式（cis)作用元件TACCGA4AT是这些胁迫诱导基因表 达所必需的调控区，与低温胁迫调节信号的作用有关，被称为脱水反应因子DRE。还有一些低温诱导基因上 有两个顺式作用元件CRT/DRE,如转录因子CBF1能结合CRT/DRE元件，CBF4能结合CBF/DREB1元件， 从而诱导低温胁迫诱导基因和水分胁迫诱导基因的表达M。由于转录因子能诱导多种低温胁迫诱导基因和 其它逆境胁迫诱导基因的表达，因而，可在很大程度上增强植物抗寒性。利用农杆菌介导法将由诱导型启动 子rd29A调控的拟南芥转录因子CBF3基因导入烟草，获得Southern阳性转基因烟草，低温胁迫实验表明， CBF3转基因烟草幼苗获得了一定的抗寒能力，特别是可溶性糖、可溶性蛋白质和游离脯氨酸含量均较对照极显著提高M。

　　4.2导人抗寒功能基因 4.2.1导入抗渗透胁迫相关基因植物在抵抗寒冻所导致的渗透胁迫过程中，体内将积累大量糖类和脯氨酸等渗透调节物质，并有多种冷 调节蛋白得以诱导表达。这些调节蛋白含大量亲水性氨基酸,具有热稳定性，且多数具有重复的氨基酸序列 和相对简单的氨基酸组成,基因启动子区域含有DRE顺式作用元件。目前，研究较深入的是LEA蛋白基因 和COR家族蛋白的基因。使COR15am多肽在转基因拟南芥中大量表达后，与野生型相比，转基因植株叶绿 体和原生质体对寒冷耐受性提高,原生质膜稳定性增强，减轻了寒冻所造成的损伤3]。

　　4.2.2导入抗冻蛋白基因

　　对植物中抗冻蛋白（AFP)的研究较晚。Griffth等在世界上首次明确指出，冷锻炼的冬黑麦（Semfe cermle L.)中有内源AFP产生，此后，世界各地在多种植物中发现了 AFP,且植物中存在的AFP较较动物中更普遍, 是抗寒冻植物对冬季低温较为普遍的适应机制。这些抗冻蛋白都具有3个基本性质：1)热滞效应;2)冰晶形 态的修饰效应;3)抑制重结晶M。由于AFPs显著的抗冻调节作用，有关AFPs蛋白基因的转基因工程近年 来开展甚多。用真空透析法将冬比目鱼afp基因导入马铃薯、拟南芥和欧洲油菜中，降低了 3种植物的自然 结冰温度;用电击法将冬比目鱼afp基因导入玉米原生质体中获得了表达，提高了玉米抗寒性；用花粉管通道 和子房注射法将整合在Ti质粒上的美洲拟鲽afp基因导入番茄中，提高了番茄抗寒性B7]。但是，在已研究过 的绝大多数植物材料中，AFP活性大大低于鱼类和昆虫中的，所研究的植物虽多达几十种，真正可被分离纯化出来的AFP尚不多。

　　4.2.3导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因

　　不同高等植物质膜中脂肪酸不饱和度和冷敏感性密切相关，膜脂中心位置顺式双键的存在可把相变温度 降至接近0°C。导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因后，其表达产物可能使一部分饱和脂肪酸催化成不饱和脂 肪酸，从而提高膜脂不饱和度，提高植物抗寒性。还有些酶可催化饱和脂肪酸中顺式双键的形成，将编码这些 酶的基因导入植物体内也可使其获得抗冷性状。将南瓜藤和拟南芥属得到的甘油3^磷酸酰基转移酶基因，导 入烟草中明显改变磷酸酰甘油的脂肪酸组成并提高其抗寒性M。将拟南芥的编码w-3脂肪酸去饱和酶FAD 基因、将菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶SAD基因分别导入烟草，均增强转基因烟草的抗寒性68。