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摘 要：依赖解旋酶DNA等温扩增技术（HDA）是近年来发明的一种新型的模拟动物体内DNA复制的等温扩增技术，HDA具有简便、高效、快速的优点，不需复杂的科学仪器，反应在常温下进行，适用于基层实验室，具有广阔的应用前景。
关键词：依赖解旋酶DNA等温扩增技术；DNA解旋酶；单链DNA结合蛋白
依赖解旋酶DNA等温扩增技术（HDA），是美国NEB公司在2004年发明的核酸等温扩增技术。依赖解旋酶DNA等温扩增技术是模拟动物体内DNA复制的过程，不需要在昂贵的PCR仪上进行反应，仅在恒温水浴锅上使用即可完成反应。
1 HDA 的原理
HDA的原理极其简单，首先用解旋酶解开双链DNA，然后依靠单链DNA结合蛋白（SSB）与模板单链相结合，使模板单链始终处于单链状态，同时保护它的完整性，然后模板与引物进行杂交，在DNA聚合酶的催化下进行扩增，新合成的双链DNA作为模板继续扩增。
2 HDA检测方法的建立要点
2.1 模板的选择
一般情况下，解旋酶的解旋能力决定着可扩增序列长度。HDA选用的是大肠杆菌解旋酶Ⅱ（UvrD）解旋酶，UvrD的解链速度是20bp/秒，连续性是100bp，因此进行扩增的模板长度为70～120bp。
2.2 酶的选择
目前常用的解旋酶是大肠杆菌解旋酶Ⅱ（UvrD），UvrD在核酸的核苷酸的切除修复和错配修复中起到了重要的解旋作用，UvrD是由720个氨基酸组成的，是SF1解旋酶家族一员。还有一种新发现的解旋酶—T7噬菌体基因4编码蛋白，解链速度是300bp/秒，扩增质粒DNA的长度是2.5kb，它的解链速度比UvrD更快，扩增长度更长。目前常用的SSB包括T4噬菌体基因32编码蛋白和RB49噬菌体基因32编码蛋白；常用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶或者是Klenow Fragment（3′-5′exo-）聚合酶。
2.3 引物设计
引物的最适长度是25～27bp，最大不超过33bp，Tm值在60～72℃，GC含量35%～44%。
3 HDA的反应体系及操作步骤
3.1 HDA的反应体系
HDA反应体系包括混合物A和混合物B，混合物A包括引物、模板、ddH2O、缓冲液；混合物B包括SSB、UvrD、三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶、MutL和缓冲液。 |
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