[摘要]目的探讨脱细胞真皮支架在高糖环境下对骨髓间充质干细胞（hBMSC）的保护作用，以及促进hBMSC向成骨细胞分化的能力。方法建立脱细胞真皮基质和含300mmol/L葡萄糖的细胞高糖模型，在高糖环境下，培养hBMSC为高糖对照组，在高糖条件下，hBMSC种植在脱细胞真皮基质上为基质实验组，正常条件下培养的hBMSC为正常对照组，每组均进行成骨细胞诱导实验。利用MTT实验检测hBMSC的增殖情况；利用骨形成蛋白-1（BMP-1）免疫荧光染色检测hBMSC成骨细胞分化情况，ELISA实验检测各组hBMSC的BMP-1、碱性磷酸酶（ALP）的含量。结果与高糖对照组比较，基质实验组hBMSC的细胞增殖光密度（OD值）升高，差异有统计学意义（P<0.01）；hBMSC在脱细胞真皮基质的生长状态良好，基质实验组BMP-1染色阳性的细胞数目明显高于高糖对照组（P<0.01）；基质实验组BMP-1、ALP等蛋白的含量明显增高（P<0.01）。结论高糖环境下，脱细胞真皮基质有利于促进hBMSC分化为成骨细胞。

　　[关键词]高糖；骨髓间充质干细胞；脱细胞真皮基质；成骨细胞

　　糖尿病是一种以高血糖为典型表现的复杂性全身疾病，高血糖状态常导致血管、神经发生严重的病理改变[1]。PalmerBF认为：糖尿病及其并发症已经成为影响我国等国家发展的重要影响因素[2]，人口老龄化和糖尿病患病人数的增多常导致糖尿病患者骨质疏松，骨折不易愈合等严重问题[3]，加重患者家庭及社会经济负担[4]。如何改善糖尿病骨质状况，加速糖尿病性骨损伤的修复是迫切需要解决的问题。

　　脱细胞皮肤基质间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）由于具有来源广泛、低免疫性、多分化等优势，为逆转糖尿病性组织缺氧和促进组织修复带来了希望，是细胞治疗和骨组织工程技术首选的种子细胞[5]。皮肤组织的再生能力非常强，脱细胞真皮细胞外基质具有复杂的三维结构[6]，是具有广泛应用前景的生物组织支架材料，对支持移植细胞生长、促进组织修复具有关键效果[6]。但是高糖状态下，MSC在脱细胞真皮基质的成骨分化尚鲜见报道。本研究拟揭示高糖环境下，MSC在脱细胞真皮基质的生长和成骨分化情况，为MSC组织工程技术促进骨组织新生，治疗高糖缺氧性骨组织损伤奠定研究基础。

　　1材料与方法

　　1.1细胞来源

　　GFP标记的人骨髓间充质干细胞（hBMSC）购于广州赛业生物公司。

　　1.2主要试剂和实验仪器

　　体重2～3kg雄性新西兰白兔购自齐齐哈尔医学院动物实验中心[动物合格证号：SYXK（黑）20140022]，胎牛血清（FBS）、α-MEM培养基、青链霉素和L-谷氨酰胺均购于广州赛业生物公司，地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、VEGF、噻唑蓝（MTT）和葡萄糖等均购于美国Sigma公司，兔抗人BMP-1抗体和TRITC标记羊抗兔IgG购自美国Santacruz公司，人骨形成蛋白-1（BMP-1）、碱性磷酸酶（ALP）的ELISA试剂盒购于美国R&D公司。Emax酶标仪为美国MolecularDevices公司产品，F-7000荧光分光光度计为日立公司产品，BX50型显微镜和SU1510型扫描电子显微镜分别为日本OLYMPUS、日立公司的产品。

　　1.3实验方法

　　1.3.1脱细胞真皮的制备8只体重2～3kg雄性新西兰白兔，按照30mg/kg耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，常规备皮、消毒，切取背部6cm×6cm全层皮肤，清理周围组织后，首先加入0.9%氯化钠溶液，在37℃摇床孵育12h，去除表皮层[6]；然后置于0.125%胰蛋白酶溶液中，37℃，消化24h，依次经过0.1%、0.5%十二烷基磺酸钠（SDS）震荡洗涤12h，60Co消毒处理密封，-80℃保存。扫描电镜观察样品结构[7-8]。

　　1.3.2细胞培养和实验分组含10%FBS的α-MEM培养基培养hBMSC，37℃、5%CO2培养者为正常对照组；若α-MEM培养基中含300mmol/L葡萄糖，则为高糖培养基。在细胞高糖模型下，未进行任何刺激的hBMSC为高糖对照组；将hBMSC种植在脱细胞真皮基质上进行培养则为基质实验组；每组细胞均进行成骨诱导分化。成骨分化培养基为：α-MEM培养基中若含10%FBS、1×10-7mol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。

　　1.3.3MTT法检测细胞增殖情况按实验分组，或在96孔板底放置脱细胞真皮基质，每组均添加1×104hBMSC后，在正常条件下培养24h。每孔加入150μL含0.1%FBS的正常或高糖α-MEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养12h；每孔加入20μL的5%MTT孵育4h，然后添加100μL二甲基亚砜，492nm波长测定每个样品吸光度（OD值）。

　　1.3.4免疫荧光染色各组分化诱导的hBMSC，DAPI进行细胞核标记，4%多聚甲醛固定，4℃条件下，用兔抗人BMP-1抗体（1∶200）孵育12h后，添加山羊抗兔IgG（1∶150），DAKO水溶性封片液进行封片。

　　1.3.5人BMP-1、ALP蛋白的检测按照人BMP-1、ALP蛋白的ELISA试剂盒说明，裂解各组细胞，提取各组细胞裂解液，ELISA实验检测人BMP-1、ALP蛋白的表达。

　　1.4统计学方法

　　所有实验均重复3次，实验数据采用SPSS18.0软件进行统计，结果以均数±标准差（x±s）表示，并进行方差分析或t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1hBMSC的增殖情况

　　正常对照组、高糖对照组和基质实验组hBMSC增殖的OD值进行方差分析，发现各组hBMSC增殖的OD值并不相等（F=247.35，P=0.0001）。与正常对照组OD值（1.453±0.164）比较，高糖对照组hBMSC的OD值（0.618±0.110）明显降低，二者比较差异有统计学意义（P<0.01）；与高糖对照组比较，基质实验组hBMSC的细胞增殖OD值（1.294±0.135）升高比较明显，二者比较差异有统计学意义（P<0.01）。

　　2.2脱细胞真皮基质结构

　　扫描电镜观察发现，未脱细胞的皮肤比较致密，见图1A；脱细胞真皮基质几乎不含细胞，纤维组织比较丰富，空隙较大，见图1B。

　　2.3各组hBMSC的BMP-1染色和扫描电镜观察

　　与高糖对照组比较，基质实验组BMP-1染色阳性的细胞明显增多，差异有统计学意义（Q=9.535，P<0.01），见图2A、2B。扫描电镜观察发现，hBMSC突起较多，与脱细胞真皮基质黏附在一起，生长状态良好，见图2C。

　　2.4ALP、BMP-1蛋白的检测

　　与未脱细胞皮肤比较，脱细胞真皮基质的ALP蛋白含量降低（P<0.05）；相对于未脱细胞皮肤，脱细胞真皮基质组的BMP-1蛋白含量降低（P<0.05），见表1。与高糖对照组比较，基质实验组的ALP蛋白含量明显增高（P<0.01）；相对于高糖对照组，基质实验组的BMP-1蛋白含量明显增高（P<0.01），见表2。

　　3讨论

　　随着世界经济、交通高速发展，全球骨损伤的发病率逐年增加；外伤、感染或肿瘤切除导致的骨组织损伤、骨延迟愈合或不连接问题是世界性骨科难题。糖尿病及其并发症已经成为困扰人们的重要疾病，由于糖尿病的高血糖状态常常导致多种离子、多糖成分代谢紊乱，进而发生糖尿病性骨质疏松等骨疾病[9]，严重影响着患病人群的健康和生命质量。

　　骨组织除了含有较多血管、神经纤维外，还含有大量骨细胞，对骨的再生修复具有重要意义。虽然利用MSC分化为骨细胞对促进骨组织损伤具有重要意义[10]，但是，如果能够在三维环境下激发间充质干细胞的成骨分化活性，将对利用组织工程技术促进糖尿病性骨损伤修复具有重要意义。皮肤是人体最大的器官，再生能力非常强，如果利用宿主皮肤构建组织工程材料将降低患者排斥反应，皮肤中含有的3D结构和有效的活性因子将有效促进种子细胞分化和生长，对治疗糖尿病骨病等具有重要意义。研究发现，存在于骨髓、脂肪等多种组织的MSC，具有多分化性能、易适应局部微环境生存等特点[11]。在缺血性心脏病、糖尿病足皮肤溃疡等许多由于缺氧引起的疾病治疗中，利用MSC细胞治疗技术或MSC组织工程技术具有喜人的治疗效果和广泛的应用[12]，并认为MSC的多分化特性更适用于糖尿病等多种组织损伤的病例[12]。也有研究发现，高糖缺氧环境会导致组织产生大量活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）[13]，ROS粒子比较微小，由于存在未配对的自由电子，因此ROS十分活跃，呈现一种不稳定自由基状态，往往导致细胞膜脂质、蛋白质等发生变性，造成MSC、血管内皮细胞等细胞器损伤，细胞生物活性降低，造成组织损伤等[14]。因此，抗高糖损伤一直是移植MSC技术确保移植细胞正常生长和分化的关键问题。如果利用自体生物组织材料既可以避免生物排斥反应，又可以促进MSC生长，达到修复骨组织损伤的目的，将较好地解决高糖环境下，移植的MSC活性降低等问题。相对于肠黏膜等部位组织，皮肤是人体最大的浅表器官，取材方便，再生能力强，符合自体生物组织材料的筛选条件[15]。

　　皮肤的细胞外基质主要由胶原蛋白、纤维蛋白、整合素等多糖或蛋白质构成复杂的三维结构，并具有良好的孔隙率和丰富的细胞活性因子等条件，可以更好地利于体内细胞的生长[16]，如果良好模拟细胞的体内生长基质，将对细胞的生长具有积极作用。近年来发现，MSC、内皮祖细胞（EPC）在静电纺丝制作的三维纳米生物材料上尚能正常生长，并对糖尿病足具有促进愈合的作用[17-18]，这些成果提示，构建脱细胞的皮肤细胞外基质会具有较好的三维立体结构，皮肤基质中的VEGF、EGF等多种细胞活性因子能够促进种植的MSC生长，对维持MSC功能、促进MSC分化具有重要影响。在本实验中，扫描电镜下也可以观察到脱细胞真皮基质的纤维组织间隙较大，纤维纵横交错，细胞结构分成非常少，说明皮肤脱细胞比较彻底，排除了皮肤细胞对实验的干扰。说明利用梯度SDS法脱细胞简单可行。相对于高糖对照组，基质实验组MSC增殖的OD值明显升高，MSC在脱细胞真皮基质的生长状态良好，说明脱细胞真皮基质的三维结构更好地模拟了体内细胞生长环境[19]，适合MSC在高糖环境的生长，此外，还可能是由于皮肤基质含有一定量的VEGF、EGF等细胞因子，这些因子对促进细胞生长和黏附于三维介质具有积极作用[20]，研究也发现，基质实验组的MSC分化为成果细胞能力明显强于高糖对照组，这进一步说明脱细胞真皮基质的确含有成骨诱导因子，可以促进MSC分化为成骨细胞。本研究利用BMP-1染色的手段，也发现基质实验组BMP-1染色的阳性细胞数明显高于高糖对照组，说明脱细胞真皮机制包含的VEGF等因子[15]积极促进了MSC在脱细胞真皮基质向成骨细胞分化。

　　综上所述，利用脱细胞真皮基质将对保护MSC抗高糖缺氧损伤，为促进MSC分化为成骨细胞带来机遇。由于皮肤基质中含有大量成骨因子，如果将含MSC的脱细胞真皮基质移植到糖尿病组织损伤区域，将对加快修复糖尿病性组织疾病具有重要意义。下一步拟将血管活性因子、趋化因子等转染到MSC内，构建含修饰后MSC的人工皮肤，观察MSC组织工程治疗糖尿病骨损伤，动员血管内皮细胞等宿主细胞归巢，加速组织损伤修复的作用和机制，为移植MSC的临床应用和细胞归巢的研究提供基础研究数据。

　　[参考文献]

　　[1]PoittevinM，BonninP，PimpieC，etal.Diabeticmicroan-giopathy：impactofimpairedcerebralvasoreactivityanddelayedangiogenesisafterpermanentmiddlecerebralarteryocclusiononstrokedamageandcerebralrepairinmice[J].Diabetes，2014，64（3）：999-1010.

　　[2]PalmerBF，CleggDJ.ElectrolyteandAcid-BaseDisturb-ancesinPatientswithDiabetesMellitus[J].NEnglJMed，2015，373（6）：548-559.

　　[3]Starup-LindeJ，VestergaardP.Managementofendocrinedisease：Diabetesandosteoporosis：causeforconcern？[J].EuropeanJournalofEndocrinology，2015，173（3）：93-99.

　　[4]刘中浩，高红伟，邢德国，等.糖尿病性骨质疏松模型雌激素、一氧化氮及转化生长因子β1的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（11）：1953-1956.

　　[5]SanzAR，CarrionFS，ChaparroAP.Mesenchymalstemcellsfromtheoralcavityandtheirpotentialvalueintissueengineering[J].Periodontol，2015，67（1）：251-267.

　　[6]TakamiY，YamaguchiR，OnoS，etal.ClinicalApplicationandHistologicalPropertiesofAutologousTissue-engineeredSkinEquivalentsUsinganAcellularDermalMatrix[J].JournalofNipponMedicalSchool，2014，81（6）：356-363.

　　[7]MorenoLA，CoxKL.QuantificationofdsDNAusingtheHitachiF-7000FluorescenceSpectrophotometerandPico-Greendye[J].JVisExp，2010（45）：2465.

　　[8]LondonoR，BadylakSF.RegenerativeMedicineStrategiesforEsophagealRepair[J].TissueEngPartBRev，2015，21（4）：393-410.

　　[9]OliveiraAL，MooreZ.Treatmentofthediabeticfootbyoffloading：asystematicreview[J].JWoundCare，2015，24（12）：560-570.

　　[10]JeonYJ，KimJ，JinHC，etal.Comparativeanalysisofhumanmesenchymalstemcellsderivedfrombonemarrow，placentaandadiposetissueassourcesofcelltherapy[J].JournalofCellularBiochemistry，2015，117（5）：1112-1125.

　　[11]KatoJ，KamiyaH，HimenoT，etal.Mesenchymalstemcellsameliorateimpairedwoundhealingthroughenhancingkeratinocytefunctionsindiabeticfootulcerationsontheplantarskinofrats[J].JDiabetesComplications，2014，28（5）：588-595.

　　[12]JacksonWM，NestiLJ，TuanRS.Concisereview：clinicaltranslationofwoundhealingtherapiesbasedonmesen-chymalstemcells[J].StemCellsTranslMed，2012，1（1）：44-50.

　　[13]QuagliaroL，PiconiL，AssaloniR，etal.PrimaryroleofsuperoxideaniongenerationinthecascadeofeventsleadingtoendothelialdysfunctionanddamageinhighglucosetreatedHUVEC[J].NutritionMetabolism&CardiovascularDiseasesNmcd，2007，17（4）：257-267.

　　[14]WangX，SngMK，FooS，etal.Earlycontrolledreleaseofperoxisomeproliferator-activatedreceptorbeta/deltaagonistGW501516improvesdiabeticwoundhealingthroughredoxmodulationofwoundmicroenvironment[J].JControlRelease，2015，197：138-147.

　　[15]BaldurssonBT，KjartanssonH，KonrádsdóttirF，etal.Healingrateandautoimmunesafetyoffull-thicknesswoundstreatedwithfishskinacellulardermalmatrixversusporcinesmall-intestinesubmucosa：anoninferioritystudy[J].InternationalJournalofLowerExtremityWounds，2015，14（1）：37-43.

　　[16]SubramanianA，SchillingTF.Tendondevelopmentandmusculoskeletalassembly：emergingrolesfortheextr-acellularmatrix[J].Development，2015，142（24）：4191-4204.

　　[17]ShenL，ZengW，WuYX，etal.Neurotrophin-3accelerateswoundhealingindiabeticmicebypromotingaparacrineresponseinmesenchymalstemcells[J].CellTransplan-tation，2013，22（6）：1011-1121.

　　[18]HeS，ShenL，WuY，etal.EffectofBrain-DerivedNeu-rotrophicFactoronMesenchymalStemCells-seededelectrospinningbiomaterialfortreatingischemicdiabeticulcersviamilieu-dependentdifferentiationmechanism[J].TissueEngineeringPartA，2014，21（5-6）：928-938.

　　[19]VapniarskyN，ArziB，HuJC，etal.ConciseReview：HumanDermisasanAutologousSourceofStemCellsforTissueEngineeringandRegenerativeMedicine[J].StemCellsTranslationalMedicine，2015，4（10）：1187-1198.

　　[20]MaoAS，MooneyDJ.Regenerativemedicine：Currentther-apiesandfuturedirections[J].ProcNatlAcadSciUSA，2015，112（47）：14452-14459.