[摘要]目的探讨长期使用核苷类似物（NA）是否导致肝脏线粒体DNA（mtDNA）D-loop区损伤。方法选取7周龄Balb/C小鼠25只，将其随机分为对照组和4个NA实验组。对照组腹腔内注射双蒸水，各实验组分别给予司他夫定（D4T）50mg/kg、齐多夫定（AZT）100mg/kg、拉米夫定（3TC）50mg/kg和去羟肌苷（DDI）50mg/kg，分别腹腔内注射，每周5次，共12周。取各组小鼠肝组织，通过激光捕获显微切割获取肝细胞，对mtDNAD-loop区克隆和测序。结果DDI组肝组织中mtDNA拷贝数（0.440±0.040）和肝细胞中mtDNA拷贝数（0.464±0.013）均较对照组[（1.000±0.080）、（1.000±0.058）]显著减少，差异均有统计学意义（均P<0.05）。D4T组肝细胞D-loop区与参考序列的平均距离为（0.0037±0.0019），3TC组为（0.0031±0.0017），DDI组为（0.0035±0.0028），与对照组（0.0018±0.0017）比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。D4T组肝细胞D-loop区平均同义替换率（dS）为（0.0060±0.0010），3TC组为（0.0050±0.0007），与对照组（0.0030±0.0007）比较差异有统计学意义（P<0.05）。DDI组肝细胞D-loop区平均错义替换率（dN）为（0.0020±0.0010），与对照组（0.0008±0.0003）比较差异有统计学意义（P<0.05）。AZT组肝组织D-loop区的“A→G”转换率（0.00190）较对照组（0.00062）高，差异有统计学意义（P<0.05）。D4T组肝细胞D-loop区的“T→C”转换率为0.00128，3TC组为0.00175，较对照组（0.00058）显著增高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论长期暴露于核苷类似物可导致小鼠肝细胞mtDNAD-loop区病变，主要突变类型为转换，主要的转换为“A→G”和“T→C”。

　　[关键词]D-loop区；线粒体DNA；肝细胞；核苷类似物

　　核苷类似物（NA）用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染[1]。NA可抑制人细胞DNA聚合酶γ，干扰核DNA修复及线粒体DNA的合成和修复，导致氧化应激和线粒体功能障碍[2]，与临床许多疾病相关，包括肌病、脂肪萎缩、神经系统疾病和乳酸酸中毒[3]。这些可能是降低抗HIV药效和患者依从性的关键因素[4]。长期应用NA的HIV感染者可发生肝脂肪变性，但NA的肝毒性原因尚不明确。笔者前期研究提示，应用NA的小鼠和HIV感染患者存在神经细胞线粒体毒性[5-6]。本研究通过观察肝组织和肝细胞的线粒体DNA（mtDNA）D-loop区序列变化，明确NA是否会诱导小鼠肝细胞mtDNA病变。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物

　　7周龄、体重28～30g的Balb/C雌性小鼠25只（军事医学科学院），按照首都医科大学动物保护和使用规定进行动物实验。

　　1.2分组及给药

　　将小鼠随机分为4个实验组[司他夫定（D4T）组、齐多夫定（AZT）组、拉米夫定（3TC）组、去羟肌苷（DDI）组]和对照组。各实验组小鼠每天分别给予腹腔内注射D4T50mg/kg、AZT100mg/kg、3TC50mg/kg、DDI50mg/kg（东北制药集团有限责任公司惠赠），每周5d，连续12周。对照组腹腔内注射双蒸水。

　　1.3实验取材

　　12周结束时，颈椎脱臼处死小鼠，迅速分离小鼠肝组织于液氮中速冻。最佳切片温度复合物包埋肝组织，-20℃将组织切为6μm薄片，置于聚乙烯包被的玻片上。行HE染色。晾干5min，2h内由有经验的病理医师应用P.A.L.MRobot-Microbeam系统（Oberkochen，德国）对切片行激光捕获显微切割（LCM）获取肝细胞[7]。

　　1.4DNA提取和实时定量PCR

　　据DNA提取试剂盒（QIAGEN中国有限公司）说明书提取肝组织和肝细胞DNA。TaqMan7900HT系统行定量PCR。细胞色素氧化酶亚基Ⅱ（COXⅡ）作为mtDNA的靶基因，核基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。CoxⅡ正向引物：5'-CGACCTAAAACCTGGTGAACTA-3'，反向引物：5'-TTGGAAGTTCTATTGGCAGAAC-3'，探针：5'-FAM-ACTGCTAGAAGTTGATAACCGAGTC-TAMRA-3'[5]。引物和探针由Invitrogen公司合成。每个样本重复3次qPCR反应。双蒸水作为阴性对照。2-ΔΔCt方法即ΔΔCt=（CtCOXⅡ-CtGAPDH）测试组-（CtCOXⅡ-CtGAPDH）对照组分析数据。

　　1.5mtDNAD-loop区的克隆和测序

　　PCR扩增肝组织和肝细胞DNA的mtDNA区。每个反应用10ng基因组DNA作为模板。mtDNAD-loop区PCR引物对：F1：5'-CTAATACCTTTCCTTCATACCTCAA-3'；R1：5'-ATTTTGGGAACTACTAGAATTGATC-3'；F2：5'-CAACCAGTAGAACACCCATTTATTA-3'；R2：5'-TGTCTTTCAAGTTCTTAGTGTTTTT-3'。双蒸水为阴性对照。PCR产物克隆于pGEM-18T载体。ABI3730基因分析仪器对每个样本随机选择的10个克隆测序。

　　1.6序列分析

　　VectorNTI套件7.0ContigExpress软件包对每个克隆的核苷酸序列组装并纠错[8]。ClustalW多序列比对程序比对序列与参考序列（NC_005089.1，GenBank）。Mega5.0Kimura双参数模型计算每组序列的序列多样性，包括平均核苷酸距离、同义替换率（dS）、错义替换率（dN）。运用Tamura3参数模型计算平均核苷酸距离、dS和dN。

　　1.7统计学方法

　　应用SPSS18.0统计软件。采用Mann-Whitney非参数检验比较组间mtDNA拷贝数差异，采用χ2检验或Fisher精确检验比较组间dS和dN差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1各组肝组织和肝细胞mtDNA拷贝数比较

　　肝组织mtDNA拷贝数：AZT组为（0.660±0.040），D4T组为（0.560±0.070），3TC组为（0.670±0.020），DDI组为（0.440±0.040），其中DDI组小鼠肝组织mtDNA拷贝数较对照组（1.000±0.080）明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）（图1A）。肝细胞mtDNA拷贝数：AZT组为（0.666±0.024），D4T组为（0.634±0.024），3TC组为（0.708±0.031），DDI组为（0.464±0.013），其中DDI组小鼠细胞mtDNA拷贝数较对照组（1.000±0.058）明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）（图1B）。

　　2.2各组肝组织和肝细胞mtDNAD-loop区序列变化比较

　　肝组织D-loop区与参考序列的平均距离：AZT组为（0.0026±0.0014），D4T组为（0.0018±0.0015），3TC组为（0.0015±0.0013），DDI组为（0.0016±0.0008）。各实验组与对照组（0.0021±0.0020）比较差异无统计学意义（P>0.05）（图2A）。肝细胞D-loop区与参考序列的平均距离：AZT组为（0.0015±0.0022），D4T组为（0.0037±0.0019），3TC组为（0.0031±0.0017），DDI组为（0.0035±0.0028）。除AZT组外，余各实验组与对照组（0.0018±0.0017）比较差异均有统计学意义（P<0.05）（图2B）。

　　肝组织D-loop区平均dS：对照组为（0.0030±0.0012），AZT组为（0.0038±0.0008），D4T组为（0.0024±0.0005），3TC组为（0.0022±0.0008），DDI组为（0.0026±0.0005），各组肝组织dS与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2C）。肝细胞D-loop区平均dS对照组为（0.0030±0.0007），AZT组为（0.0030±0.0010），D4T组为（0.0060±0.0010），3TC组为（0.0050±0.0007），DDI组为（0.0038±0.0016）。D4T组和3TC组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图2D）。

　　肝组织D-loop区平均dN：对照组为（0.0010±0.0007），AZT组为（0.0014±0.0009），D4T组为（0.0006±0.0003），3TC组为（0.0006±0.0002），DDI组为（0.0006±0.0004）。各组肝组织dN与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2E）。肝细胞D-loop区平均dN：对照组为（0.0008±0.0003），AZT组为（0.0006±0.0005），D4T组为（0.0006±0.0005），3TC组为（0.0010±0.0007），DDI组为（0.0020±0.0010）。仅DDI组存在相对高的dN值，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图2F）。

　　2.3各组肝组织和肝细胞mtDNAD-loop基因突变

　　肝组织D-loop区序列单碱基的转换率：AZT组为0.0023，D4T组为0.0017，3TC组为0.0004，DDI组为0.0008，各实验组与对照组（0.0017）比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图3A）。“A→G”转换率：AZT组为0.00190，D4T组为0.00093，3TC组为0.00000，DDI组为0.00028，AZT组较对照组（0.00062）显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图3B）。肝细胞D-loop区序列单碱基的转换率：AZT组为0.0015，D4T组为0.0027，3TC组为0.0022，DDI组为0.0021，D4T组较对照组（0.0016）明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图3C）。“T→C”转换率：AZT组为0.00064，D4T组为0.00128，3TC组为0.00175，DDI组为0.00058，D4T组和3TC组较对照组（0.00048）显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）（图3D）。

　　3讨论

　　研究表明，约20%的接受抗逆转录病毒治疗的患者出现肝损伤[9]；12%接受干扰素+利巴韦林联合抗逆转录病毒治疗的HIV/HCV混合感染患者，表现出无症状的线粒体毒性[10]。抗逆转录病毒药物的肝毒性可能会促进HIV/HCV混合感染患者的肝纤维化。此外，抗病毒治疗相关的免疫重建可能会减轻患者HCV相关的肝脏损害[11]。NA能否对肝脏产生线粒体毒性尚不清楚。

　　NA可通过与自然脱氧核苷三磷酸竞争，抑制核或mtDNA多聚酶和DNA复制的链终止[12]。最近研究表明，非NA逆转录酶抑制剂导致的肝毒性涉及内质网（ER）应激/未折叠蛋白，通过线粒体相关的ER膜（MAMs）介导的Ca2+交换和能量代谢障碍[13]。本研究提示小鼠暴露于NA3个月后肝细胞存在线粒体毒性。mtDNAD-loop区位于线粒体基因组非编码区，具有许多重要的转录和复制元素，极易发生突变[14]。D-loop区突变可能先于肿瘤发生，并可能在肿瘤发生过程中累积[15]。mtDNAD-loop区与年龄、物种进化和各种退行性疾病相关[16]。本研究通过分析各NA组肝组织和肝细胞D-loop区的突变，提示NA，特别是D4T和DDI，能够导致小鼠肝细胞mtDNAD-loop区序列多样性和点突变的发生，NA诱导的小鼠肝细胞D-loop区最常见的碱基突变类型为转换。

　　综上所述，长期暴露于NA可导致小鼠肝细胞mtDNAD-loop区突变，主要突变类型为转换，主要为“A→G”和“T→C”，部分揭示了长期应用NA出现肝脏病变的原因。

　　[参考文献]

　　[1]SetoWK，LiuK，WongDK，etal.PatternsofhepatitisBsurfaceantigendeclineandHBVDNAsuppressioninAsiantreatment-experiencedchronichepatitisBpatientsafterthreeyearsoftenofovirtreatment[J].JHepatol，2013，59（4）：709-716.

　　[2]DragovicG，JevtovicD.TheroleofnucleosidereversetranscriptaseinhibitorsusageintheincidenceofhyperlactatemiaandlacticacidosisinHIV/AIDSpatients[J].BioPharm，2012，66（4）：308-311.

　　[3]DaganT，SableC，BrayJ.Mitochondrialdysfunctionandantiretroviralnucleosideanalogtoxicities：whatistheevidence？[J].Mitochondrion，2002，1（5）：397-412.

　　[4]LapinskiTW，Parfieniuk-KowerdaA，TrzosA，etal.HBVmutationsassociatedwithlamivudinetherapy[J].PrzeglEpidemiol，2013，67（4）：611-616，705-708.

　　[5]ZhangY，SongF，GaoZ，etal.Long-termexposureofmicetonucleosideanaloguesdisruptsmitochondrialDNAmaintenanceincorticalneurons[J].PLoSOne，2014，9（1）：e85637.

　　[6]ZhangY，WangM，LiH，etal.AccumulationofnuclearandmitochondrialDNAdamageinthefrontalcortexcellsofpatientswithHIV-associatedneurocognitivedisorders[J].BrainRes，2012，1458（6）：1-11.

　　[7]RookMS，DelachSM，DeynekoG，etal.WholegenomeamplificationofDNAfromlasercapture-microdissectedtissueforhigh-throughputsinglenucleotidepolymorphismandshorttandemrepeatgenotyping[J].AmJPathol，2004，164（1）：23-33.

　　[8]LiuF，YuDM，HuangSY，etal.Clinicalimplicationsofevolutionarypatternsofhomologous，full-lengthhepatitisBvirusquasispeciesindifferenthostsafterperinatalinfection[J].JClinMicrobiol，2014，52（5）：1556-1565.

　　[9]AntoniadesC，MacdonaldC，KniselyA，etal.MitochondrialtoxicityassociatedwithHAARTfollowinglivertransplantationinanHIV-infectedrecipient[J].LiverTranspl，2004，10（3）：699-702.

　　[10]LagunoM，MilinkovicA，deLazzariE，etal.IncidenceandriskfactorsformitochondrialtoxicityintreatedHIV/HCV-coinfectedpatients[J].AntivirTher，2005，10（3）：423-429.

　　[11]MaciasJ，CastellanoV，MerchanteN，etal.EffectofantiretroviraldrugsonliverfibrosisinHIV-infectedpatientswithchronichepatitisC：harmfulimpactofnevirapine[J].AIDS，2004，18（5）：767-774.

　　[12]WesterCW，EdenSK，ShepherdBE，etal.Riskfactorsforsymptomatichyperlactatemiaandlacticacidosisamongcombinationantiretroviraltherapy-treatedadultsinBotswana：resultsfromaclinicaltrial[J].AIDSResHumRetroviruses，2012，28（8）：759-765.

　　[13]ApostolovaN，Gomez-SucerquiaLJ，AlegreF，etal.ERstressinhumanhepaticcellstreatedwithEfavirenz：mitochondriaagain[J].JHepatol，2013，59（4）：780-789.

　　[14]ChangSC，LinPC，YangSH，etal.MitochondrialD-loopmutationisacommoneventincolorectalcancerswithp53mutations[J].IntJColorectalDis，2009，24（6）：623-628.

　　[15]AlhomidiMA，VedicherlaB，MovvaS，etal.MitochondrialD310instabilityinAsianIndianbreastcancerpatients[J].TumourBiol，2013，34（4）：2427-2432.

　　[16]AbdullaevSA，AnishchenkoES，GazievAI.MutantcopiesofmitochondrialDNAintissuesandplasmaofX-raysexposedmice[J].RadiatsBiolRadioecol，2010，50（3）：318-328.