摘要：人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESCs）是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性。无论在体内还是体外环境，人胚胎干细胞都能分化为机体几乎所有类型的细胞基于其全能分化性，胚胎干细胞成为治疗各种退行性疾病的理想细胞来源。然而，在目前培养条件下所建立的胚胎干细胞株，仍然存在动物源性物质潜在污染的问题。因此，更优化的建株及培养条件十分重要。 

　　关键词：人胚胎干细胞（hESC）；内细胞团；饲养层细胞；培养条件；mTESRl 

　　人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESCs）是从早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性，基于这些特性，胚胎干细胞可以被广泛地利用于个体发育研究、药物药理、干细胞移植治疗等多个领域。尤其是胚胎干细胞移植治疗方面，被认为是治疗由于细胞退化及功能丧失所导致的多种退行性疾病的最有前景的治疗手段。1998年美国Thomson实验室建立起第一株人胚胎干细胞，同年，SHAMBLOTT小组从人原生殖嵴细胞及肠系膜细胞中分离出多能干细胞，以后的十几年中，虽然人胚胎干细胞的建株及维持培养条件不断地改进，但仍然没有解决异源性物质潜在污染的问题，最优化的培养条件的建立对于干细胞研究的发展以及最终的临床应用都是极其重要的。在此，本文从不同方面总结了在人胚胎干细胞建株和维持培养条件上所取得的进步。 

　　1经典的建株和维持培养方法与存在的问题 

　　经典的胚胎干细胞建株的方法是基于小鼠胚胎干细胞建株与维持培养方法的基础上的，采用免疫外科学的方法，用Tyrode's液去除透明带，用动物抗人抗体与囊胚的滋养层细胞结合，清洗并添加不含抗体的培养基，然后利用动物血清使滋养层细胞溶解，从而得到内细胞团（inner cellmass，ICM），继而将ICM转移到以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）或者永生的MEF（STO line）怍为饲养层细胞（feeder cell）的条件中培养，最终得到胚胎干细胞。建立起来的胚胎干细胞株具有以下几个方面的特点：1）具有无限增殖的能力及自我更新、自我修复的能力，且在增殖过程中能够保持核型的稳定性；2）细胞表达全能性基因；3）无论在体内还是在体外环境中，都能分化成为机体所有类型的细胞。自此后的许多年，人们一直延用这种建株及维持培养的方法，但是这种方法有其不可避免的弊端，传统的培养办法中采用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，同时在培养基中包含了一些动物源性的成分，这些外源性成分会对人胚胎干细胞造成潜在的污染，使其存在应用的风险。 

　　2建株的细胞来源及细胞分离方法的发展情况 

　　2.1干细胞的来源 

　　传统的方法通过获得ICM，继续培养来建立胚胎干细胞株。有研究人员采用将已经建成的人胚胎干细胞与体细胞融合以及利用孤雌生殖的方法来获得囊胚，继而从中获得胚胎干细胞，这种方法所获得的细胞，由于染色体数目上的异常，并不是理想的方法。人们也尝试从桑葚期的胚胎和已经停止发育的胚胎中获得胚胎干细胞，但是由于建株成功率太低（1.5%），也不能成为有效的办法。采用类似于植入前诊断（preimplantationgenetic diagnosis，PGD）的方法，Chung等通过显微操作的手段，从处于8细胞期的胚胎中取出单卵裂球，与亲辈胚胎共培养后，转移到培养皿中培养，以期使具体的个体可以有遗传背景完全一致的全能干细胞，并成功建立起胚胎干细胞株。然而，没有一个被取出单卵裂球的胚胎继续发育成为一个完整的个体，使得这种方法不能被广泛地应用。有学者利用体细胞核移植（somatic cellnuclear transfer，SCNT）技术，将已经建立起来的胚胎干细胞的细胞核移植到卵细胞内，继续培养至囊胚后从中分离内细胞团建株，但是，利用这种方法并没有建立起胚胎干细胞株。为了获得疾病特异性的多能干细胞，有学者通过逆转录病毒载体转染和基因重编程的方法，使得已经是终末分化的体细胞重新具有干细胞的特性，这就是我们所熟悉的诱导多功能干细胞（induced pluripotent stemcell，iPS）。这种方法建立起来的iPS株具有一定的优势，由于体细胞是取自接受移植治疗患者本人，这就最大程度避免了异体移植有可能产生的移植排斥反应，成为了获得干细胞的另一重要来源。 

　　2.2内细胞团的分离方法 

　　第一株人胚胎干细胞的分离过程中，使用了动物抗人抗体及动物血清等动物源性的成分，由于这些动物源性成分可能对人胚胎干细胞造成潜在的污染，使得用这种方法建立起来的人胚胎干细胞株在后期的应用中存在风险。利用机械法直接分离囊胚的透明带以及滋养层细胞来获取ICM或用酶消化的方法去除透明带从而分离ICM，在一定程度上避免了ICM与动物源性成分的直接接触，从未来的使用方面来说是比较理想的分离1CM的办法。此外，通过利用激光束在透明带上打孔，在显微镜下，利用固定针固定囊胚，用活检针将囊胚从透明带中取出，之后，直接将取出的囊胚在培养皿中培养，或再利用激光束将ICM与滋养层细胞进一步分离，再在培养皿中培养，这种方法也是一种可行的方法。也有学者采用将单卵裂球与已经建成的干细胞共培养的方法来获得胚胎干细胞，但这种方法建株的效率不高。 

　　3饲养层细胞的发展与无饲养层细胞培养条件 

　　3.1饲养层细胞 

　　传统的方法使用MEF作为饲养层细胞来维持胚胎干细胞的生长，但是由于潜在污染的问题，MEF并不是最理想的滋养层细胞。有研究者指出，MEF能够为胚胎干细胞提供更多的增殖空间，而HFF（human foreskin fibroblast，HFF）分泌的生长因子能够更好的促进胚胎干细胞的生长，鉴于这个特点，以期能更好的支持胚胎干细胞的生长，人们使用小鼠成纤维细胞跟人包皮成纤维细胞按比例混合而成的混合饲养层细胞来培养hESC，相对利用单一的饲养层细胞相比较来说，生长在单一的饲养层细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、较薄，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于单一饲养层，但是这种方法并没有避免异源性物质的污染问题。为了找寻非动物源性的饲养层细胞，人们采用了处于不同发育阶段的不同组织来源的人体细胞作为MEF的替代品，如：人类包皮成纤维细胞、胎盘细胞、子宫内膜细胞、成人骨髓基质细胞、胎儿肌肉细胞、胎儿皮肤细胞。尽管不同的细胞取得的效果不同，但都能使干细胞保持未分化的状态。此外，胚胎干细胞自身分化所形成的成纤维细胞样细胞也能成为一个自体的饲养层细胞来源。由此得到的饲养层细胞，具有特异性，避免了动物源性成分或异源性成分对于胚胎干细胞的污染。

　　3.2无饲养层细胞培养条件 

　　为了进一步纯化胚胎干细胞以减少日后使用的风险，有学者提出是否能够采用成分明确的物质的组合来彻底替代饲养层细胞的粘附功能及分泌功能，为了解决这个问题，van Hoof等利用基底膜基质（Matrigel）和纤连蛋白（fibronectin）来代替饲养层细胞的功能，同时，利用饲养层细胞条件培养基（feeder conditioned media）跟成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor）维持干细胞的未分化状态，这种方法取得了不错的效果。事实上，这种无饲养层细胞的培养条件能够很好地维持胚胎干细胞的生长及未分化状态，许多实验室现在都采用这种条件培养胚胎于细胞。