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选取由株1S幼穗经过3周诱导培养所得的新鲜愈伤组织，先于继代培养基中继代培养1个周期.然后将愈伤组织转移至分别添加2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0mg/L2，4D的MS基本培养基中，诱变处理1个周期（图1（b））.经诱变处理的愈伤组织再转移至继代培养基中继代培养1个周期，以恢复其活力.最后选取活力较好的胚性愈伤组织进行分化和生根培养（图1（c）和（d）），所得分化苗（R1）经炼苗后移栽至大田中.抽穗期套袋使其自交结实，并单株收种（R2）.再将收集的种子按株系播种于大田中，按照刘选明等[13]方法于整个生长发育时期考察R2代株系的农艺性状.与对照（未经诱变的植株）相比，只要某个肉眼可见的性状发生显著变异即被视为突变株系.诱变频率计算公式为：诱变频率=变异株系数/总的再生株系数×100%. 1.2.5不同外植体对诱变频率的影响 分别选取株1S的幼穗、幼胚和成熟胚作为外植体诱导愈伤组织.先继代1个周期，然后在4.0mg/L2，4D的MS培养基上诱变1个周期.其后的步骤与2，4D浓度对诱变频率影响的实验方法相同.最后分别统计3种外植体对诱变频率的影响. 1.2.6矮秆突变体的筛选和表型鉴定 具体方法参照我们先前发表的一篇论文[14]，主要于R2代考查其株高性状，并观察其性状分离情况.对于比原亲本水稻株高有所降低而且能稳定遗传的突变株系，于抽穗期套袋使其自交结实和采收种子（R3），同时考察和评价其农艺性状.对符合目标性状且稳定遗传的变异株即为优良诱变品种（系）. 1.2.7茎的单位长度干物质含量分析 于成熟期分别随机选择株1S和SV14S各20株，先测量整个茎秆的长度，然后将各节间分开，分别测量各节间长度.将各节间再置于50°C烘箱烘烤16h，于分析天平称取各节间重量.最后，根据所得的数据，计算整个茎秆和各节间重量（mg）/长度（cm）的比值.另外，统计突变株系SV14S的重量（mg）/长度（cm）比值的增加率.其计算公式为：增加率=[SV14S的比值（mg/cm）-株1S的比值（mg/cm）]/株1S的比值（mg/cm）×100%. 2结果与讨论 2.1继代时间对植株再生的影响 已有研究发现[15]，组织培养的体细胞变异频率随培养时间的延长而提高.但是随着培养时间的延长，其愈伤组织的分化频率也急剧下降，往往导致再生苗分化的极度困难.因此，我们首先研究了继代时间对植株再生的影响，以寻找愈伤组织的最佳继代时间.以25d为一个培养周期，挑取刚从株1S幼穗诱导出来的颜色淡黄、质地致密的胚性愈伤组织于继代培养基进行继代培养，分别继代0～9个周期，然后转接到分化培养基上观察并统计分化频率.其中，继代0周期的胚性愈伤组织即为刚从幼穗诱导出来的胚性愈伤组织转接到分化培养基.实验结果发现，当继代4个周期以上，其愈伤组织的分化频率急剧下降，由继代3个周期时的59.0%急降至15.8%左右（图2（a））.因此，为了保持较高的分化频率和变异频率（由继代时间决定），我们认为在高浓度2，4D诱变处理前的最佳继代时间为3个周期. 2.3不同外植体对诱变频率的影响 在水稻组织培养中，一般选用幼穗、幼胚和成熟胚作为外植体[13，16-17].在3种外植体中，究竟哪种最适合作为体细胞无性系变异的外植体呢？迄今还未见相关研究内容的文献报道.于是我们研究了水稻幼穗、幼胚和成熟胚等3种外植体对诱变频率的影响.研究结果发现，由幼穗诱导的愈伤组织的诱变频率达到了24.7%，由幼胚诱导的为5.2%，而由成熟胚诱导的仅为3.8%（图2（c））.在单一性状的变异方面，由幼穗诱导的愈伤组织的诱变频率也很高.如由株1S幼穗诱导、诱变和再分化得到的500株分化苗中，经在海南陵水基地的表型鉴定，发现共有24株表现出株高不同程度的矮化.就株高性状的变化来说，其突变率达到了4.8%（24/500）（表2）.而由成熟胚诱导的愈伤组织经诱变和再分化后得到的分化苗中，几乎没有发现矮化突变株（结果未列出）.由此可以看出，在体细胞无性系诱变的外植体中，幼穗明显优于幼胚和成熟胚.其可能的原因是处于花粉母细胞形成时期的水稻细胞在离体培养条件下对外界环境更敏感，更易发生变异.另外，幼穗作为外植体还有具有愈伤组织诱导率高和活力强等优势（结果未列出）.因此，体细胞无性系诱变育种的最佳外植体为幼穗. 2.4不同品种的体细胞突变频率的分析 通过上面以株1S为材料进行的继代时间、2，4D浓度和不同外植体对诱变和分化频率的影响，初步建立了以幼穗为外植体，以4.0mg/L2，4D为最佳诱变浓度的体细胞无性系诱变方法.为了进一步验证该方法的有效性，我们对包括株1S在内的水稻品种中9B，R527和316B等进行了无性系诱变.为了实验的准确性，仅以单一性状的突变进行统计分析.在生产中，株1S，中9B和R527的株高偏高，导致所配组合抗倒伏性差，而316B的种子颖壳闭合度差，容易导致种子霉变和发芽率降低.因此，在株1S，中9B和R527中，以矮秆或半矮秆突变株系进行统计分析，而316B则以种子颖壳闭合度好的突变株系进行统计分析.实验结果发现，诱变频率最高的是株1S，在500株分化苗中共得到了24个矮化变异株系，其诱变频率达到了4.8%（24/500）.诱变效率最低的是316B，在236株分化苗中仅得到了1个种子颖壳闭合度较好的突变株系，其诱变频率仅为0.42%（1/236）.中9B和R527分别为2.33%和1.42%（表2）.由此说明，体细胞无性系的突变率还取决于品种间的基因型差异. 2.5矮秆突变株系的表型分析 |
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