论文发表,核心期刊网 权威中文核心期刊目录检索网
你好,欢迎来到论文发表,核心期刊网 权威中文核心期刊目录检索网! 设为首页 收藏本站
联系电话
论文范文 当前位置: 首页 > 写作指南 > 论文范文 >

IFN-γ对MMP-2、-9和TIMP-1在HL-60细胞中表达的影响

时间:2018-11-07 09:44来源:未知 作者:刘心 , 王婷 , 杨华 点击:
【摘要】 目的 研究白血病细胞株HL-60中基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)和基质金属蛋白酶天然抑制剂-1(TIMP-1)的表达及细胞因子干扰素 (IFN-)对MMP-2、MMP-9和TIMP-1转录水平的调节。方法 分别在HL-60细胞生长的不同时期(1-5d)收集细胞,采用半定量RT-PCR
       【摘要】 目的 研究白血病细胞株HL-60中基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)和基质金属蛋白酶天然抑制剂-1(TIMP-1)的表达及细胞因子干扰素 (IFN-γ)对MMP-2、MMP-9和TIMP-1转录水平的调节。方法 分别在HL-60细胞生长的不同时期(1-5d)收集细胞,采用半定量RT-PCR方法,分析白血病细胞株HL-60中MMP-2、MMP-9和 TIMP-1 mRNA的表达水平;以不同浓度的IFN-γ作用于HL-60细胞,24、48 h后RT-PCR检测MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA水平的变化。结果 细胞接种后24 h MMP-2和MMP-9的mRNA水平最高,但TIMP-1表达相对恒定。IFN-γ各个浓度组对MMP-2和MMP-9 mRNA表达均有抑制作用(P<0.05),且随着作用浓度的增高mRNA表达减少;TIMP-1对其调节不敏感。结论 明确了白血病HL-60细胞株在转录水平表达MMP-2、MMP-9和TIMP-1;IFN-γ对MMP-2、MMP-9 mRNA表达有明显的抑制作用,而对TIMP-1转录无明显作用。
    【关键词】 基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶抑制剂;白血病;干扰素-γ  
   基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一类结构上具有极大同源性、活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶,主要生理功能是降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分。对MMP在实体瘤中的作用研究表明,MMP不但介导肿瘤细胞对宿主包括基底膜在内的ECM的降解,影响肿瘤的侵袭和转移,还调控肿瘤新生血管的形成,影响细胞黏附分子的功能以及调控肿瘤细胞的生长[1-2]。白血病的浸润过程是多基因、多步骤、多阶段相互作用的级联反应,其中MMP介导的 ECM及基底膜的降解过程是肿瘤侵袭、转移的一个关键步骤。MMP-2和MMP-9是此过程的关键因子。MMP活性又受到其天然抑制剂的调节[3]。研究发现,MMP、基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)和微环境中的细胞因子三者之间相互调节,构成一个交叉网络而发挥其功能。许多细胞因子对MMP-2和MMP-9有调节作用。为了进一步了解白血病的浸润和转移机制,寻求白血病治疗的新靶点,我们采用细胞培养和RT-PCR等方法,观察了MMP-2、MMP-9和TIMP-1基因在白血病细胞中的表达情况,旨在探讨MMP-2、9在白血病发病机制中的作用,以及细胞因子IFN-γ对其表达的影响。如何快速发表论文
  1  材料与方法
  1.1  细胞株的培养及分组
  急性髓系白血病细胞株HL-60由西安交通大学医学院第一附属医院分子中心实验室惠赠。细胞培养液由RPMI-1640培养液、100 mL/L灭活小牛血清及100 u/mL的青、链霉素组成。HL-60细胞置于37 ℃、50mL/L CO2饱和湿度的培养箱中悬浮培养,2-3 d换液一次,实验用细胞处于对数生长期。将HL-60细胞以5×104细胞/mL接种于培养瓶中,分别在细胞生长的不同时期(1-5 d)收集细胞,用于RT-PCR。IFN-γ对MMP-2、MMP-9和TIMP-1转录水平的调节实验中,将细胞分为空白对照组(不加IFN-γ)及 IFN-γ 10、50、100、200、500 u/mL组。
  1.2  药物、试剂及设备
  IFN-γ纯度99%(晶美生物公司);RPMI-1640培养基(GIBCO公司);新生牛血清、胎牛血清(民海生物工程有限公司);DEPC(Sigma公司);Trizol Reagent(Invitrogen公司);反转录试剂盒(Fermentas公司);2×PCR Taq Mix(广州东盛生物科技有限公司)。CO2孵箱(National Appliance Company);GeneAmp PCR System 2400(PERKIN ELMER, USA);紫外透射反射检测分析仪(上海复生生物工程研究所)。如何快速发表论文
  1.3  RT-PCR法检测MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达
  1.3.1  细胞内总RNA的提取
  所用试剂、器具、试管均经去Rnase处理,所有实验器具、试管、橡胶和塑料均用DEPC浸泡过夜后高压消毒。取各实验组细胞(每组细胞数为 4×105)离心弃上清后,加入TRIZOL 1 mL反复吹吸至细胞完全溶解,加入氯仿孵育离心后取无色的水相上层,加入异丙醇孵育离心后,取底部胶样团块即为沉淀的RNA。乙醇洗涤、干燥后,溶解于 DEPC处理过的三蒸水中,储存于-70 ℃。紫外分光光度仪测量RNA的浓度A260/280的比值;10 g/L琼脂糖凝胶电泳(200 V,30 min),检查18 S和28 S带的存在。如何快速发表论文
  1.3.2  cDNA的制备
  无核酶的Eppendorff管中加入Oligo(dT)16 1 μL和RNA 1 μg,70 ℃加热后冰上迅速冷却,经短暂离心后,再分别加入5×Reactive Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mixture 1 μL、RibolockTM Ribonuclease inhibitor 1 μL,70 ℃加热后冰冻、离心,加入1 μL MMLV(逆转录酶,200单位),42 ℃孵育60 min,然后70 ℃下加热10 min灭活反应。将转录的cDNA储存于-20 ℃,2周内进行PCR反应。
  1.3.3  引物设计与合成
  PCR引物由引物设计软件Priemier primer设计合成,并经由blast进行同源性分析(上海Sangon公司合成)。MMP-2:上游5′-TGACGGTAAGGACGGACTC- 3′,下游5′-TGGAAGGGAATGGAAAC-3′,扩增片段长度为324 bp;TIMP-1:上游5′-TTCCACAGGTCCCACAAC-3′,下游5′-GCATTCCTCACAGCCAAC-3′,扩增片段长度为 165 bp;MMP-9:上游5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′,下游5′-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGTT-3′,扩增片段长度为308 bp;β-actin:上游5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′,下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′,扩增片段长度为621 bp。如何快速发表论文
  1.3.4  PCR反应
  2×PCR Taq Mix(100 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L MgCl2、0.2 g/L明胶)12.5 L,Primer 1(10 μmol/L) 1 μL,Primer 2(10 μmol/L) 1 μL,cDNA模板1.0 μL,ddH2O加至总体积25 μL。分别按不同条件扩增目的基因片段:MMP-2循环参数为94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;MMP-9循环参数为94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;TIMP-1循环参数为94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;β-actin循环参数为94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环。以未经逆转录的总RNA作为阴性对照。
  1.3.5  PCR产物的检测和分析
  取PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳,电压恒定为75 V,电流约为30 mA。Genesnap软件对凝胶电泳条带照相,用图像分析仪(Image Master)扫描,Genetools软件行灰度值分析,以目的条带与内参条带的吸光度体积的比值(MMP-2/β-actin、MMP-9/β- actin、TIMP-1/β-actin)代表目的基因mRNA的相对水平。
  1.4  统计学处理
  实验共重复3次,每次各种作用浓度的细胞3瓶。实验结果以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用Dunnett-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
  2  结果
  2.1  HL-60细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达 如何快速发表论文
  HL-60细胞表达MMP-2、MMP-9,细胞接种后24h MMP-2和MMP-9的mRNA水平最高。HL-60细胞在第2天进入对数生长期,生长状态良好。细胞表达相对恒定的TIMP-1(图1)。
  图1  MMP-2、-9和TIMP-1在HL-60细胞中的表达
  Fig.1 Expression of MMP-2, 9 and TIMP-1 in HL-60 cell line at various time2.2  IFN-γ对HL-60细胞MMP-2、MMP-9 和TIMP-1表达的调节作用  空白对照组(不加IFN-γ)及IFN-γ 10、50、100、200、500 u/mL组,作用24、48 h后收获细胞。RT-PCR检测药物作用的各组细胞MMP-2、9的基因表达均较空白对照下降(图2、图3),而作用各组间TIMP-1基因表达无明显变化(图4)。统计学分析结果显示,IFN-γ各个浓度组均对MMP-2、MMP-9 mRNA有抑制作用(P<0.05),且随IFN-γ作用浓度的增高而mRNA表达逐渐减少,即表现为对剂量的依赖关系,而TIMP-1表达恒定,IFN-γ对其的调节不明显(表1)。表1  IFN-γ对HL-60细胞中MMP-2、-9和TIMP-1的表达的影响(略)
  3  讨论
  白血病作为一种造血系统的恶性克隆性疾病,在其发生、发展的过程中与骨髓微环境的变化有很大关系。MMP是骨髓微环境中不可或缺的组成部分,其家族成员能够降解EMC的所有组成成分[4]。MMP-2和MMP-9 属于MMP家族的Ⅳ型胶原酶,以酶原形式分泌,作用底物主要为Ⅳ型胶原和变性的明胶,其表达和活性受其内源性抑制剂TIMP的影响,二者活性平衡对于维持细胞外基质的稳定至关重要[4]。有研究表明,NHL细胞的高侵袭性和转移性与细胞表达MMP-2、MMP-9、降解EMC和基底膜、协助瘤细胞向原发部位基质外扩散有关[5]。国内研究发现,MMP-2和MMP-9水平可反映多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者的肿瘤负荷,其升高与血管新生和MM病情进展及肿瘤浸润等病理过程有关[6-7]。而骨髓微环境中发生的MMP与ECM相互作用的紊乱,不仅抑制了造血干/祖细胞的分化成熟,而且使原始及幼稚细胞提前从骨髓中释出,加速了白血病的发展。Kuittinen等[8]认为MMP-2的表达对急性髓系白血病的预后有良好的相关性。这说明,在急性髓性白血病的发生、发展过程中,MMP-2和MMP-9发挥着重要作用。因此,了解MMP-2和MMP-9在白血病的作用机制及对其表达或活性作用的调控显得十分重要。为此,我们用RT-PCR的方法,从基因水平检测了在急性髓性白血病细胞株HL-60细胞中 MMP-2、MMP-9的表达变化。结果显示,HL-60细胞可以表达MMP-2和MMP-9,并且在细胞接种24 h二者表达水平最高,说明二者在白血病的发生、发展中有一定的作用。
  此外,我们试图找出对MMP-2、MMP-9表达及其活性有调控作用的因素,以期可以抑制其表达活性。已有研究表明,除可溶性因子以外,细胞外基质与细胞之间、黏附分子介导的细胞与细胞之间的相互作用也对 MMP的基因表达有明显的调控作用。杨琳等[9]研究表明,血管内皮生长因子可上调AML患者MMP的表达,共同参与白血病髓外浸润的发生。但目前的研究大多是针对MMP的转录激活方面的,而对MMP的负调控因子的研究相对较少。干扰素是病毒感染细胞分泌的抗病毒功能蛋白,其中IFN-γ具有比较突出的细胞生长抑制作用。王苹等[9]研究发现,IFN-γ可以明显抑制Hep-2喉癌细胞的MMP-2、MMP-9 mRNA的表达,降低肿瘤细胞的侵袭性。Galboiz等[11]研究发现IFN-γ可下调多发性硬化症患者的单核细胞MMP-2、TIMP-2、 MT1-MMP的表达。本研究结果显示,实验范围内不同浓度的IFN-γ均可显著降低HL-60细胞中MMP-2、MMP-9 mRNAs的表达(P<0.05),且随着IFN-γ浓度增高,mRNA表达量逐渐减少,即表现为对剂量的依赖关系。这与IFN-γ在其他肿瘤中对 MMP-2和MMP-9转录水平的抑制作用相同。Ma等[12]证实IFN-γ可以抑制MMP-9表达,该抑制效应是由削弱转录引起的,可能是STAT- 1α途径依赖的过程,调节局部浸润的单核细胞合成MMP。但也有研究显示,IFN-γ对单核细胞MMP表达的调节非常复杂,在不同的细胞因子环境下 IFN-γ对单核细胞产生MMP的作用不同。比如当与GM-CSF联合使用时,IFN-γ通过刺激TNF-α的产生而引起MMP-1的表达;而通过活化 caspase8由p38-STAT1途径介导,IFN-γ可抑制TNF-α引起的MMP-9合成[13]。
  为了更进一步分析IFN-γ对MMP-2、MMP-9抑制作用的可能机制,实验还对白血病细胞株HL-60中TIMP-1的表达以及IFN-γ对其调节作用进行了研究。 TIMP是MMP的天然组织抑制物,既可以在MMP酶原激活的阶段抑制MMP的激活,也可在激活后抑制MMP的活性。其中TIMP-1是MMP-9相关的生理性抑制因子。实验结果显示,细胞内TIMP-1 mRNA的表达水平相对恒定,且各种浓度的IFN-γ对其表达的调控作用不明显。因此,我们推测IFN-γ对HL-60细胞MMP-9的抑制作用可能是对基因本身转录的直接抑制作用,而非间接通过抑制TIMP-1的表达使MMP-9 mRNA的表达量降低。
  本实验证实了白血病细胞株HL-60可以表达MMP-2和MMP-9,且IFN-γ对其表达活性有抑制作用。由于MMP-2和MMP-9在白血病的浸润、进展中起着非常重要的作用,并对白血病预后也有重要意义,因此,本实验可能为白血病的治疗提供了一个新的重要靶点,并为今后临床的深入研究奠定了初步的实验基础。目前,以MMP-2和MMP-9为靶标的抑制剂正用于肿瘤转移模型及人类癌症的临床研究,在确定TIMP用于肿瘤治疗之前,还有许多基础工作有待完成。目前已有一些人工合成的TIMP,如marimastat、BMS-275291、 AE-941(neovastat)和COL-3(metastat),已应用于III期临床试验[14-15],但效果还不是十分理想,考虑可能是 MMP在体内的作用机制十分复杂,尚需要进一步研究。
    参考文献: 
  [1]Polette M, Mawrocki-Raby B, Gilles C, et al. Tumour invasion and matrix metalloproteinases [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2004, 49(1):179-186.
  [2]贾占奎,杨锦建,余炜伟. 膀胱移行癌组织中MMP-2、MMP-9蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2006, 41(3):570-571.
  [3]胡晓霞,李力,黎单戎,等. MMP-9、2、7及其抑制剂TIMP-1、2、3在卵巢肿瘤组织中的表达及临床意义 [J]. 癌症, 2004, 23(10):1194-1198.
  [4]Furukawa A, Tsuji M, Nishitani M, et al. Role of the matrix metalloproteinase and tissue inhibitors of metalloproteinase faimilles in non-invasive and invasive tumors transplanted in mice with severe combined immunodeficiency [J]. Urology, 1998, 51(5):849-853.
  [5]钟美佐,黄进,翟晓,等. MMP-9,MMP-2在非霍奇金淋巴瘤病理组织中的表达及意义 [J]. 现代肿瘤学, 2006, 14(2):218-220.
  [6]黄仲夏,季风清,陈世伦. 多发性骨髓瘤患者MMP-2和MMP-9表达的研究 [J]. 中国癌症杂志, 2006, 16(7):578-580.
  [7]Sfiridaki A, Miyakis S, Tsirakis G, et al. Systemic levels of interleukin-6 and matrix metalloproteinase-9 in patients with multiple myeloma may be useful as prognostic indexes of bone disease [J]. Clin Chem Lab Med, 2005, 43(9):934-938.
  [8]Kuittinen O, Savolainen ER, Koistinen P, et al. Gelatinase A and B (MMP-2, MMP-9) in leukaemia MMP-2 may indicate a good prognosis in AML [J]. Anticanceres Res, 1999, 19(5C):4395-4400.
  [9]杨琳,董作仁,潘树鹏,等. 急性髓系白血病82例患者VEGF与MMP-2、MMP-9的相关性研究 [J]. 中国实验血液学杂志, 2006, 14(1):15-20.
  [10]王苹,杜宝东,杜波,等. TNF-β和IFN-γ对Hep-2 喉癌细胞MMPs表达的调节作用 [J].吉林大学学报(医学版), 2002, 28(6):587-590.
  [11]Galboiz Y, Shapiro S, Lahat N, et al. Modulation of monocytes matrix metalloproteinase-2, MT1-MMP and TIMP-2 by interferon-γ and-β: implications to multiple sclerosis [J]. J Neuroimmunol, 2002, 131(1-2):191-200.
  [12]Ma Z, Qin H, Benveniste EN. Transcriptional suppression of matrix metalloproteinase-9 gene expression by IFN-γ and IFN-beta [J]. J Immunol, 2001, 167(9):5150-5159.
  [13]Zhou M, Zhang Y, Ardans JA, et al. Interferon- gamma differentially regulates monocyte matrix metalloproteinase-1 and -9 through tumor necrosis factor-α and caspase 8 [J]. J Biol Chem, 2003, 278(46):45406-45413.
  [14]Yip D, Ahmad A, Karapetis CS, et al. Matrix metalloproteinase inhibitors: applications in oncology [J]. Invest New Drugs, 1999, 17(4):387-399.
  [15]Wojtowicz-Praga S. Clinical potential of matrix metalloprotease inhibitors [J]. Drugs In R&D, 1999, 1(2):117-129.


  核心期刊网(www.hexinqk.com)秉承“诚以为基,信以为本”的宗旨,为广大学者老师提供论文发表、写作指导、核心期刊推荐等服务。
  核心期刊网专业期刊发表机构,为学术研究工作者解决北大核心CSSCI核心统计源核心EI核心等论文发表咨询与写作指导的问题。

  论文发表咨询电话:15261143176
  论文发表客服QQ: 论文投稿1002080872 论文投稿1003158336
  论文发表投稿邮箱:hexinqk365@126.com
------分隔线----------------------------
栏目列表  
推荐论文  
热点论文  
 
QQ在线咨询
论文发表热线:
152-6114-3176
微信号咨询:
hexinqk.com
网站简介 核刊总览 普刊专栏 期刊验证 学术答疑 服务流程 写作指南 支付方式 信用说明 联系我们
CopyRight © 2013 论文发表,核心期刊网 权威中文核心期刊目录检索网 All Rights Reserved.
免责声明:本站提供论文发表 论文投稿 发表论文 核心期刊检索 核心论文发表等服务,本站刊载文章仅代表作者观点
并不意味着本站认同,部分作品系转载,版权归原作者或相应的机构;若某篇作品侵犯您的权利,请来信告知:hexinqk365@126.com