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刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响

时间:2018-11-05 11:05来源:未知 作者:刘天丹 , 黄良国 , 点击:
【摘要】 目的 观察刺五加(AS)对脑出血(ICH)大鼠脑细胞凋亡及其对凋亡调控蛋白Bcl?2、Bax的影响及对ICH脑组织的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组与治疗组。治疗组又分为AS大剂量组和小剂量组。用胶原酶注入大鼠尾状核建立
    【摘要】 目的 观察刺五加(AS)对脑出血(ICH)大鼠脑细胞凋亡及其对凋亡调控蛋白Bcl?2、Bax的影响及对ICH脑组织的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组与治疗组。治疗组又分为AS大剂量组和小剂量组。用胶原酶注入大鼠尾状核建立ICH模型。治疗组给予AS干预,在不同时间点处死大鼠,测定血肿周围组织细胞凋亡、 Bcl?2和Bax水平。结果 AS治疗组分别于12 h、1、3、7 d凋亡细胞低于模型组(P<0.01,P<0.05)。AS治疗组Bcl?2水平分别于12 h、1、3、7 d表达高于模型组(P<0.01,P<0.05)。Bax于12 h、1、3、7 d时AS治疗组表达低于模型组(P<0.01,P<0.05)。结论 AS能明显减少ICH后神经细胞凋亡,升高Bcl?2表达水平,降低Bax表达,保护ICH后神经细胞。
  【关键词】 脑出血;刺五加;细胞凋亡;Bcl?2;Bax
   脑出血(ICH)后血肿周围组织继发性损伤机制研究为临床药物干预治疗ICH提供了科学依据。刺五加(AS)对缺血性脑损伤的治疗作用已被临床与动物实验所证实,对于出血性脑血管病,临床上也已广泛应用。AS治疗ICH机制,目前尚不完全清楚。本实验旨在观察ICH后血肿周围组织神经细胞凋亡和Bcl?2、Bax蛋白表达基础上,采用AS干预治疗,探讨AS对其影响及脑保护作用。
  1  材料与方法
  1.1  实验材料
  健康Wistar大鼠126只,雄性,体重250~300 g,由中国人民解放军第三军医大学大坪医院动物中心提供;原位末端标记法(TUNEL)试剂盒购于美国Roche公司;Ⅶ型胶原酶(1.5 kU/支)购于美国Sigma公司;兔抗大鼠Bcl?2、Bax单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购于北京博奥森生物工程有限公司;AS注射液(20 ml/支,批号200703162)由黑龙江完达山制药厂生产。
  1.2  实验方法
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  1.2.1  动物模型制作
  参照Rosenberg的大鼠ICH模型制作方法〔1〕,实验大鼠禁饮食12 h之后,以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上。局部消毒后“丁”字形剪开颅顶皮肤,按照《大鼠脑立体定位图谱》〔2〕定位尾状核,前囟为0点,向右旁开3 mm,向前0.2 mm,牙科钻钻透颅骨,钻孔直径0.8 mm,微量注射器针头垂直刺入脑组织,进针5.5 mm(右侧尾状核所在部位)。向大鼠的右侧尾状核缓慢注入0
  .5 μl(1 U)胶原酶,留针10 min后缓慢拔出穿刺针,缝合皮肤,予局部消毒。假手术组以等量生理盐水代替胶原酶注入右侧尾状核。动物苏醒后,放回笼内饲养,正常进食进水,室温37℃左右。
  1.2.2  大鼠选入标准
  根据Bederson神经缺损体征评分法〔3〕进行综合等级评分。缺损体征达3级及以上者为制模成功。断头取脑后沿进针道切开可见明显血肿。不符合条件的大鼠弃去,重新补充。
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  1.2.3  大鼠分组与给药  随机将大鼠分为5组。
  ①正常组:大鼠6只,普通饲养,不作任何处理,饲养1 w后断头取脑制作标本。
  ②假手术组:大鼠30只,普通饲养,术后3 h以2 ml生理盐水腹腔注射,以后每日1次,直到处死为止。
  ③模型组:大鼠30只,制作ICH模型(见上述)术后处理同假手术组。
  ④AS小剂量组:制模成功后,每日给予AS注射液,6.25 ml/kg体重,加生理盐水至2 ml,每日1次腹腔注射。
  ⑤AS大剂量组:制模成功后,每日给予AS注射液31.25 ml/kg体重,分2次腹腔注射,二次注射间隔8 h以上,直到处死为止。除正常组外分别在术后6、12 h、1、3、7 d断头取脑制作标本,每个时间点观察6只大鼠。
  1.2.4  组织取材 怎么发表论文
  在相应的时间点用水合氯醛麻醉大鼠,开胸,左心室插管灌注,右心耳剪开引流。先灌注生理盐水150 ml,再以4%多聚甲醛灌注至大鼠发白僵硬,然后快速断头取脑。沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处,可见血肿灶。以穿刺点为中心,冠状面取厚度5 mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4 h,脱水后石蜡包埋。以血肿灶为中心制作水平位脑组织切片,切片厚度4 μm做苏木素?伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。
  1.3  检测方法
  1.3.1  HE染色方法观察组织病理学变化
  切片经梯度酒精水化、HE染色、封片等程序处理后,在光学显微镜下观察血肿周围组织病理变化。
  1.3.2  血肿周围组织细胞凋亡水平  TUNEL染色法检测细胞凋亡。切片经过氧化氢、复合消化液处理,加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),37℃孵育1 h,用链霉亲和素孵育,DAB显色,HE复染。对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)代替人末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。阳性细胞核呈棕黄色颗粒状。高倍光镜下(400倍)计算凋亡指数(AI),即每张片选取不重叠10个细胞数最多的高倍视野,计算每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比和10个视野的平均凋亡细胞百分数,再计算每个时间点(6张切片)平均凋亡细胞百分数。
  1.3.3  血肿周围组织Bcl?2与Bax的表达检测
  采用SP方法,加1∶200兔抗大鼠Bcl?2、Bax一抗,经过二抗处理,链霉亲和素孵育,DAB显色,HE复染。Bcl?2与Bax阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。计算每个时间点(6张切片)平均阳性细胞数,方法同前述。
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  1.4  统计学处理
  采用SPSS13.0统计学处理软件,数据采用x±s表示。经过方差齐性检验后,组间两两比较采用单因素方差分析。
  2  结果
  2.1  病理形态学结果
  HE染色400倍切片中,可观察到血肿周围部分细胞体积缩小,细胞核浓染,细胞核染色质聚集于细胞核一侧呈新月形,并大小不等的核碎片,见图1。
  2.2  AS对血肿周围组织细胞凋亡的影响
  凋亡细胞在TUNEL染色下胞核呈棕褐色。正常组和假手术组仅有少量凋亡细胞,两组比较差异不明显(P>0.05);模型组、 AS小剂量组与AS大剂量组,6 h凋亡细胞数即明显高于假手术组,1 d达高峰,之后逐渐下降,但至7 d仍较假手术组显著增高(P<0.01);AS小剂量组与模型组比较,凋亡细胞数于12 h减少(P<0.05),1、3、7 d明显减少(P<0.01);AS大剂量组与模型组比较,凋亡细胞数于12 h、1 d、3 d、7 d明显减少(P<0.01);AS大剂量组与AS小剂量组相比,凋亡细胞数于1、3 d减少(P<0.05),7 d明显减少(P<0.01)。见图1和表1。表1  AS对大鼠ICH后细胞凋亡的影响(略)
  2.3  AS对血肿周围组织Bcl?2表达的影响
  Bcl?2阳性细胞SP染色时胞浆呈棕褐色,主要表达于大脑皮质与基底节区。Bcl?2表达水平:假手术组各时间点与正常组对比无显著差异(P>0.05);模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6 h时即有表达,12 h时达高峰,之后逐渐下降,7 d仍有相对较高表达。三组之间差异明显。模型组各时间点均明显高于假手术组(P<0.01);AS小剂量组12 h表达高于模型组(P<0.05),1、3、7 d表达明显高于模型组(P<0.01);AS大剂量组于12 h、1d时表达较AS小剂量组增高(P<0.05),3、7 d表达明显高于AS小剂量组(P<0.01)。见图1和表2。表2  AS对大鼠ICH后Bcl?2的影响(略)
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  2.4  AS对血肿周围组织Bax表达的影响
  Bax主要表达于血肿周围区,阳性表达细胞SP染色胞浆呈棕褐色。假手术组与正常组很少表达,两组无显著差异(P>0.05);模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6 h时较少表达,12 h时开始增加,1 d达高峰,3 d明显下降,7 d仍有表达,三组间有明显差异。模型组于各时间点均较假手术组明显增加(P<0.01);AS小剂量组表达于12 h低于模型组(P<0.05),1、3、7 d明显低于模型组(P<0.01);AS大剂量组于12 h、1 d、3 d低于AS小剂量组(P<0.05),7 d明显低于AS小剂量组(P<0.01)。见图1和表3。表3  AS对大鼠ICH后Bax的影响(略)
  3  讨论
  细胞凋亡是由多基因调控的细胞程序性死亡过程,是一种基本生命现象,具有维持机体正常生理过程和多细胞生物正常发育成熟的作用。细胞凋亡受到机体的严密调控,其过程是瀑布式基因表达过程,许多基因参与这一过程。其中包括Bcl?2基因家族。该基因家族可分抗凋亡(Bcl?2、Bcl?XL等)和促凋亡(bax、bad、bid等)两大亚族。由Bcl?2基因表达的 Bcl?2蛋白是一种膜合蛋白,包括分子量各为26 kD的Bcl?2α和21 kD的Bcl?2β两种相似蛋白,存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜等处,主要功能是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。作用机制与抑制氧自由基产生、抑制 Ca2+释放、阻止半胱氨酸蛋白酶?3(Caspase?3)激活、抑制Bax蛋白的促凋亡作用以及抑制细胞色素C释放等方面有关。Bax蛋白是 Bcl?2的同源蛋白,同样存在于线粒体外膜、内质网膜和核被膜的细胞质面,能够增加线粒体膜通透性,使细胞色素C释放至细胞质并与衔接蛋白即凋亡蛋白激活因子(Apaf?1)结合,促进Caspase级联反应,导致细胞死亡。Bax还通过与Bcl?2蛋白结合形成异二聚体,使Bcl?2失去抑制细胞凋亡的作用。正常细胞中,存在Bax与Bcl?2微量表达,细胞是否发生凋亡,依赖于Bcl?2/Bax的比例〔4〕。
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  研究〔5〕表明,细胞凋亡是ICH后脑组织损伤的主要原因。ICH后神经细胞死亡分为坏死和凋亡。坏死以神经细胞肿胀和溶解为特征,包括群体细胞死亡和继发炎症反应。凋亡则以细胞核皱缩形成凋亡小体为特征。血肿压迫、血肿局部血流量下降、自由基大量产生、炎症反应〔6〕、凝血酶〔7〕及血液成分如血红蛋白等因素均可诱发或加重细胞凋亡。细胞凋亡可以被外界因素如药物、低温等中止,因而抑制细胞凋亡可促进神经功能恢复。本实验通过应用AS干预大鼠 ICH模型,观察其对ICH后凋亡细胞的影响。
  AS注射液是一种中药制剂,系AS茎叶精制而成的无菌水溶液。主要化学成分为异嗪皮定、β?谷甾醇、异秦皮定甙、紫丁香树酯醇甙等。根据祖国医学,AS具有补肾安神、益气固本、活血通络、强身延年之功效。近年来临床应用AS注射液治疗ICH 取得明显效果〔8〕,但其治疗机制仍待深入探讨。本实验显示,细胞凋亡伴随ICH而大量产生。但治疗组12 h、1、3、7 d凋亡细胞数明显低于模型组,且大剂量组疗效明显优于小剂量组。表明AS可明显对抗ICH神经细胞凋亡。其机制可能为:①AS具有清除氧自由基,升高超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低过氧化脂质LPO)作用〔9〕;②扩张脑血管,增加血肿周围局部血流量〔10〕。可减轻脑水肿,改善微循环,降低血黏度,抑制血小板聚集;③具有抗炎作用〔11,12〕,抑制炎症因子对血肿周围组织的损伤。减少炎症因子产生,从而降低了某些炎症因子参与的细胞凋亡过程。
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  Bax于ICH后6 h即有表达,1 d达高峰,表明Bax表达高峰期与细胞凋亡一致,显示其与细胞凋亡一致性。Bcl?2在ICH后12 h达高峰,表达高峰较Bax提前,此可能与ICH损伤诱发细胞的保护机制激活有关。ICH时,血肿的占位导致血肿周围组织血流量下降,局部缺血缺氧,产生大量自由基和其他细胞因子〔13〕,诱发细胞凋亡。AS通过Bcl?2表达升高阻止以上因素所诱导的细胞凋亡,发挥抗凋亡作用。ICH后细胞凋亡和 Bcl?2、Bax的表达均呈现规律性的变化,从6 h至7 d,ICH后Bcl?2与Bax表达均明显高于正常组与对照组,显示在细胞凋亡调控过程中,各种因子之间的相互拮抗作用。AS干预后于12 h、1、3、7 d可明显提高Bcl?2表达,于12 h、1、3 d可降低Bax表达,大剂量组尤为明显。提示AS可能通过升高Bcl?2表达,降低Bax表达而抑制细胞凋亡,从而发挥脑保护作用。
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